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.2004年6月15日；101(24):8870-5.
doi:10.1073/pnas.0308605101。 Epub 2004年6月1日。

SUMO-1对红系转录因子GATA-1的修饰

利西奥·科拉文 1, 莫妮卡·戈蒂萨, 法比奥·阿沃利奥, 保拉·塞科, 安东内拉·隆奇, 克劳迪奥·桑托罗, 吉安尼奥·德尔·萨尔
附属公司

SUMO-1对红系转录因子GATA-1的修饰

利西奥·科拉文等。 美国国家科学院程序. .

摘要

转录因子的活性受到影响稳定性、定位和蛋白质相互作用的翻译后修饰的严格调控。与SUMO的结合是一种可逆的翻译后修饰，已被证明可以调节参与细胞增殖、分化和肿瘤抑制的重要转录因子。在这里，我们证明了红系转录因子GATA-1在体外和体内被酰化，并绘制了参与SUMO-1附着的单个赖氨酸残基。我们发现核环指蛋白PIASy促进GATA-1的sumoylation并显著抑制其转录活性。我们提供的证据表明，在哺乳动物细胞中，一个非肿瘤性GATA-1突变体与WT蛋白在其处理报告基因的能力以及在爪蟾外植体中触发内源性珠蛋白表达的能力方面没有区别。这些观察结果对GATA-1翻译后修饰的生物学作用提出了有趣的问题。

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数字

图1。
图1。
GATA-1的示意图和SUMO附着点周围区域的线形。强调了符合sumoylation共识基序的氨基酸。箭头指向小鼠GATA-1中的赖氨酸137。
图2。
图2。
GATA-1已聚合在体外和体内.(A类)体外GATA-1的sumoylation。放射性标记在体外如图所示，翻译后的GATA-1在SUMO结合途径重组成分的存在下孵育。GATA-1的两种亚型可见（见正文）。GST-SUMOΔ6是一种C末端截断，缺乏连接到底物所需的甘氨酸残基。反应通过SDS/PAGE分离，并通过放射自显影术进行可视化。(B类)293T细胞中GATA-1的Sumoylation。在293T细胞中转染WT GATA-1或K137R突变体，转染或不转染表达GFP-SUMO-1的载体。用SDS/PAGE分离裂解产物，用免疫印迹法检测GATA-1。(C类)骨肉瘤细胞中GATA-1的Sumoylation。将WT GATA-1或K137R突变体与GFP-SUMO-1一起转染MG63细胞。用GATA-1单克隆抗体免疫沉淀裂解液，用SUMO-1抗体免疫印迹(左侧). 指示IgG重链。在总裂解物中也检测到GATA-1和GFP-SUMO-1(赖特). 星号表示这些细胞中GATA-1抗体识别的非特异性带。(D类)小鼠红白血病细胞中GATA-1的酰化。用SUMO-1抗体免疫沉淀小鼠红白血病细胞的裂解液，用GATA-1抗体免疫印迹。用一种不相关的单克隆抗体进行免疫沉淀作为阴性对照。
图3。
图3。
动物帽中的血液诱导和红细胞标记物的RT-PCR分析。将80个编码WT GATA-1或K137R突变体的capped mRNA微微图注射到爪蟾胚胎，含或不含2 ng mRNA编码的HA-SUMO-1。在第8-9阶段切除动物帽，并在50 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子的存在下孵育。当同胞胚胎达到30-35期时，用放射性RT-PCR分析红细胞标记物αT3珠蛋白和xGATA-1。使用不识别注射小鼠GATA-1 mRNA的引物扩增内源性xGATA-1。扩增EF1α作为RNA水平的对照。
图4。
图4。
PIASy增强GATA-1的sumoylation并抑制GATA-1转录活性。(A类)PIASy增加了GATA-1的sumoylation。将WT GATA-1或K137R突变体与GFP-SUMO-1和表达T7-PIASy的载体一起转染293T细胞中。用SDS/PAGE分离裂解产物，用免疫印迹法检测GATA-1。(B类)PIASy抑制GATA-1依赖性交易激活。将GATA-1应答荧光素酶报告质粒与表达GATA-1、GFP-SUMO-1和T7-PIASy的载体一起转染到U2OS细胞中。组成性表达质粒雷尼利亚荧光素酶（pRL-CMV）作为转染效率的对照。GATA-1转录活性通过双荧光素酶分析测定(上部)，并通过免疫印迹分析GATA-1蛋白(下部). 车道3中箭头所示的带可能对应于与内源性SUMO共轭的GATA-1。(C类)PIASy抑制GATA-1转录活性不需要Sumoylation。使用WT GATA-1或如上所述的不可杀真菌K137R突变体在U2OS细胞中进行报告实验。转染后36 h进行双重荧光素酶检测。下部显示了GATA-1和T7-PIASy在一个典型实验中的表达水平，该实验通过免疫印迹检测。(D类)PIASy抑制红系细胞中GATA-1转录活性。在转染WT GATA-1的指定细胞系中进行了报告实验，如图所示，该细胞系含有或不含有T7-PIASy。转染后36 h进行双重荧光素酶检测。在没有PIASy的情况下，相对荧光素酶活性表示为GATA报告者活性的百分比。
图5。
图5。
PIASy与GATA-1相互作用并特异性抑制其转录活性。(A类)PIASy不抑制GATA-1依赖性启动子。在人金属硫蛋白最小启动子（hMT）、人c-myc启动子或GATA响应启动子控制下表达萤光素酶的构建体在有或没有T7-PIASy的U2OS细胞中转染，如图4所示。GATA报告者的实验还包含所示GATA-1蛋白的表达载体。在没有PIASy的情况下，相对荧光素酶活性表示为启动子活性的百分比。下部显示了PIASy在一个典型实验中的表达水平。(B类)PIASy与GATA-1之间的互动。如图所示，WT GATA-1或K137R突变体与T7-PIASy一起转染293T细胞。36小时后，用GATA-1单克隆抗体免疫沉淀裂解产物，用T7表位抗体免疫印迹(赖特). 还分析了总裂解物中GATA-1和T7-PIASy的表达(左侧). IgG重链用星号表示。
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