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.2004年3月10日；24(10):2527-34.
doi:10.1523/JNEUROSCI.4315-03.2004。

神经元特异性载脂蛋白e4蛋白水解与转基因小鼠脑中tau磷酸化增加相关

沃尔特·布莱希特 1, Faith M Harris公司, 张胜军, 伊娜·泰瑟, 桂秋雨, 秦旭, Jo Dee鱼, 托尼·怀斯·科雷, 曼纽尔·巴蒂尼, 伦纳特·穆克, 罗伯特·马利, 黄亚东
附属公司

神经元特异性载脂蛋白e4蛋白水解与转基因小鼠脑中tau磷酸化增加相关

沃尔特·布莱希特等人。 神经科学. .

摘要

载脂蛋白E（apoE）存在于阿尔茨海默病（AD）大脑中的淀粉样斑块和神经纤维缠结（NFT）中，但其在其发病机制中的作用尚不清楚。此前，我们在AD脑中发现载脂蛋白E的C末端截断片段，并表明这些片段可导致神经退行性变，并可在培养的神经细胞和转基因小鼠中诱导NFT样内含物。在这里，我们通过Western blotting分析了在神经元[神经元特异性烯醇化酶（NSE）-apoE]或星形胶质细胞[胶质纤维酸性蛋白（GFAP）-apoE]中表达apoE3或apoE4的转基因小鼠脑组织匀浆中apoE的片段。载脂蛋白E的C末端截短片段以年龄依赖性的方式在NSE-apoE4小鼠和NSE-apo E3小鼠的大脑中积累，但程度要小得多；然而，在GFAP-apoE3或GFAP-apoE4小鼠中未检测到片段。在NSE-apoE小鼠中，apoE片段化的模式与AD大脑中的模式相似，并且片段化对某些大脑区域是特定的，发生在易受AD相关神经退行性变影响的新皮质和海马体中，但不在较不易受影响的小脑中。红藻氨酸激发毒性攻击显著增加NSE-apoE4小鼠的apoE片段，但不增加NSE-apoE3小鼠的apo E片段。磷酸化τ（p-tau）在NSE-apoE4小鼠中也以年龄依赖性的方式积累，在NSE-apoE3小鼠中积累的程度要小得多，但在GFAP-apoE3或GFAP-apoE4小鼠体内没有积累。21个月大的NSE-apoE4小鼠海马神经元内p-tau内含物显著，但在NSE-apo E3小鼠中几乎未检测到。因此，潜在致病性载脂蛋白E C末端截断片段的积累取决于载脂蛋白e的亚型和细胞来源。apoE4的神经元特异性蛋白水解裂解与tau磷酸化增加有关，可能在AD相关神经元缺陷的发展中起关键作用。

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数字

图1。
图1。
ApoE片段发生在人类和NSE-ApoE小鼠的大脑中，但不发生在GFAP-ApoE小鼠的脑中。来自非强化人类对照组（73岁）和AD患者（71岁；A类)、NSE-apoE小鼠（7-9个月龄；B类)和GFAP-apoE小鼠（年龄8-10个月；C类)用全长apoE或C末端apoE抗体进行Western blotting分析。在C类分析了GFAP-apoE小鼠脑中apoE的表达水平与NSE-apoE小鼠相似（2个右通道）或高出6倍（3个左通道）的apoE。
图2。
图2。
NSE-apoE4小鼠脑中apoE片段的区域特异性。NSE-apoE4小鼠脑组织(n个= 4; 年龄4-5个月），解剖成新皮质、海马和小脑并均质。用抗全长ApoE的多克隆抗体通过Western blotting检测匀浆中的ApoE。A类，代表性Western blot。B类，通过测量apoE片段与全长apoE的比率来量化apoE碎片。注意，载脂蛋白E片段在新皮质和海马体中比在小脑中更为显著(第页<0.001，新皮质或海马与小脑）。
图3。
图3。
海人酸攻击NSE ApoE小鼠的ApoE片段化。在7-8个月大时，NSE-apoE3和NSE-ape4小鼠腹腔注射生理盐水或红藻氨酸（KA；n个=每个基因型和治疗4个）。6天后对其进行分析。对脑匀浆（150μg总蛋白）中的载脂蛋白E进行SDS-PAGE，并用抗全长载脂蛋白e的多克隆抗体进行免疫印迹检测。A类，通过测量所有apoE片段（14-30 kDa）与全长apoE的比率来量化apoE碎片(第页<0.01，NSE-apoE4小鼠的KA vs生理盐水）。B类通过密度分析，将样品的条带（全长apoE加上apoE片段）与不同数量的重组人apoE3或apoE4的标准品进行比较，确定总apoE水平。
图4。
图4。
NSE-apoE4小鼠脑中载脂蛋白E C末端截短片段的年龄依赖性积累。A类用全长ApoE抗体免疫印迹法检测NSE-apoE3或NSE-apo E4小鼠脑匀浆中的ApoE。B类、定量分析NSE-apoE3和NSE-ape4小鼠脑匀浆中载脂蛋白E的C末端截短片段与全长载脂蛋白e的比值(n个=4-6每种基因型和年龄；第页<0.01，apoE3与所有年龄段的apoE4小鼠相比）。
图5。
图5。
NSE-apoE4小鼠脑中p-tau的年龄依赖性积累。NSE-apoE小鼠脑匀浆中的p-Tau(A、 B类)和GFAP-apoE小鼠(C类)用单克隆抗体AT8进行免疫印迹分析。注意，与老年NSE-apoE3小鼠相比，老年NSE-apoE4小鼠凝胶顶部的抗SDS p-tau聚集体水平更高。D类，定量分析NSE-apoE3和NSE-apo E4小鼠脑匀浆中的抗SDS p-tau聚集体(n个=4-6每种基因型和年龄；第页<0.01，在7-21个月时，apoE3与apoE4小鼠的比较）。mE，鼠标apoE。
图6。
图6。
老年NSE-apoE4小鼠海马神经元内p-tau内含物的形成。21个月大的NSE-apoE4脑切片(A类)和NSE-apoE3(B类)用单克隆抗体AT8对小鼠进行免疫染色。NSE-apoE4小鼠CA3区神经元内p-tau阳性内含物丰富(A类)但在NSE-apoE3小鼠的CA3区几乎没有检测到(B类).C类，对21个月大的NSE-apoE4和NSE-apoE3小鼠中含有p-tau阳性内含物的神经元的定量分析(n个=每个基因型5个；第页apoE3小鼠与apoE4小鼠相比P<0.01）。D-F公司，通过抗apoE和抗p-tau双重免疫荧光染色测定21个月龄NSE-apoE4小鼠海马神经元内内含物中apoE4-和p-tau的克隆化。G-I公司，通过抗apoE和抗p-NF双重免疫荧光染色测定21个月龄NSE-apoE4小鼠海马神经元内内含物中apoE5和磷酸化神经丝（p-NF）的克隆化。J型，通过电子显微镜观察NSE-apoE4转基因小鼠海马中直径为17±3 nm的神经元内直丝（放大倍数30000×）。
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