Modification of de novo DNA methyltransferase 3a (Dnmt3a) by SUMO-1 modulates its interaction with histone deacetylases (HDACs) and its capacity to repress transcription

doi:10.1093/nar/gkh195

.2004年1月29日；32(2):598-610.

doi:10.1093/nar/gkh195。 2004年印刷。

SUMO-1修饰新生DNA甲基转移酶3a（Dnmt3a）调节其与组蛋白脱乙酰酶（HDAC）的相互作用及其抑制转录的能力

严玲¹, Umesh T Sankpal公司, 安德烈亚·罗伯逊, 詹姆斯·麦克纳利, 塔蒂亚娜·卡波娃, 基思·D·罗伯逊

附属公司

PMID： 14752048
预防性维修识别码： PMC373322型
内政部： 10.1093/nar/gkh195

SUMO-1修饰新生DNA甲基转移酶3a（Dnmt3a）调节其与组蛋白脱乙酰酶（HDAC）的相互作用及其抑制转录的能力

严玲等。核酸研究. 2004.

.2004年1月29日；32(2):598-610.

doi:10.1093/nar/gkh195。 2004年印刷。

作者

严玲¹, Umesh T Sankpal公司, 安德烈亚·罗伯逊, 詹姆斯·麦克纳利, 塔蒂亚娜·卡波娃, 基思·D·罗伯逊

附属

¹表观基因调控与癌症科，LRBGE/NCI/NIH，41号楼，41 Library Dr.，Bethesda，MD 20892，美国。

PMID： 14752048
预防性维修识别码： PMC373322型
内政部： 10.1093/nar/gkh195

摘要

新生DNA甲基转移酶Dnmt3a是三种哺乳动物DNA甲基转移酶类之一，已被证明在胚胎发育、基因组印记和转录沉默中发挥关键作用。尽管Dnmt3a很重要，但人们对其酶活性和转录抑制功能是如何调节的知之甚少。在这里，我们表明Dnmt3a与sumoylation机制的多个成分相互作用，即E2 sumo结合酶Ubc9和E3 sumo连接酶PIAS1和PIASxalpha，所有这些都参与将小泛素样修饰多肽sumo-1与其靶蛋白结合。在体内和体外，Dnmt3a被SUMO-1修饰，Dnmt 3a负责相互作用的区域映射到N末端调控域。在功能上，Dnmt3a的琥珀酰化破坏了其与组蛋白脱乙酰化酶（HDAC1/2）相互作用的能力，但不会与另一个相互作用伙伴Dnmt3 b相互作用。体内增强Dnmt3a的sumoylation的条件消除了其抑制转录的能力。这些研究揭示了调节Dnmt3a的新水平，翻译后修饰可以显著调节其与特定蛋白伙伴的相互作用，并改变其抑制转录的能力。

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数字

图1
在酵母双杂交筛选中，Dnmt3a与Ubc9、PIAS1和PIASxα结合。将全长Dnmt3a与GAL4-DBD融合，并在高严格选择条件下，在针对AH109酵母细胞中的人胎肝cDNA文库的酵母双杂交筛选中用作诱饵。使用Y187酵母细胞中的β-半乳糖苷酶测定法确认在选择性培养基上生长呈阳性的克隆，然后测序。两个具有代表性的独立克隆的身份如β-半乳糖苷酶活性图所示（作为相对单位）。阳性对照（+）是p53和SV40 T抗原之间的相互作用，阴性对照（-）是p5和层粘连蛋白B之间的相互影响，“仅诱饵”是在适当的选择条件下单独的GAL4-Dnmt3a结构。通过western blotting证实全长Dnmt3a在AH109细胞中的表达（数据未显示）。值是三个独立实验的平均值，误差线是平均值的标准偏差。

图2
Dnmt3a与Ubc9、PIAS1和PIASxα相互作用体内和*在体外*. (A类)使用针对标记的Dnmt3a或Ubc9的抗体，在转染COS-7细胞的全细胞提取物中与Ubc9共免疫沉淀。Ubc9的内源性水平较高（未显示），我们可以检测到Dnmt3a–Ubc9与Ubc9表达载体联合转染或不联合转染的相互作用。(B类)Dnmt3a与PIAS1和PIASxα共同免疫沉淀，使用针对Dnmt3 a（或标记的Dnmt3a）或PIAS蛋白的抗体。在每种情况下，用2.0µg每种所示表达构建物转染COS-7细胞48小时。然后制备全细胞提取物，并用每个面板左侧所示抗体（IP-ab）进行免疫沉淀，清洗，剩余结合蛋白在SDS-PAGE凝胶上溶解，然后使用每个面板左侧所示的抗体进行西方分析（W ab）。(C类)Dnmt3a与Ubc9、PIAS1和PIASxα结合*在体外*在GST下拉测定中。单独使用GST或每个面板顶部显示的GST融合蛋白（与谷胱甘肽-脑葡萄糖珠结合）与*在体外*转录和翻译³⁵S-标记蛋白（IVT）并广泛洗涤。在顶部面板中，GST单独用作与IVT-Dnmt3a的非特异性结合的对照，而在下部面板中，IVT-荧光素酶用作与GST-Dnmt 3a的非特异性结合的对照。每个面板右侧的箭头表示存在特异结合蛋白。在某些情况下，IVT反应产生两个间隔很近的产物，很可能是由内部蛋氨酸残基引发的。

图3
Ubc9、PIAS1和PIASxα通过N末端调控域内的区域与Dnmt3a相互作用。Dnmt3a蛋白的示意图显示在顶部，并显示了PWWP、PHD和催化域。将融合到GAL4-DBD的每个Dnmt3a缺失突变体与Ubc9（左）、PIAS1（中）或PIASxα（右）的GAL4-AD融合物共同转化到AH109酵母细胞中。粗线表示融合到GAL4-DBD的Dnmt3a区域。选择三个菌落在每个转化的高严格选择下生长，在液体培养中生长，然后用于β-半乳糖苷酶分析（相对单位）。图表显示了三个独立实验（菌落）相对于设置为100%的全长Dnmt3a的平均值。误差线是平均值的标准偏差。

图4
Dnmt3a在转染细胞中与Ubc9、PIAS1和PIASxα共定位。(A类)将生长在玻璃盖片上的NIH3T3细胞与GFP-Dnmt3a和Ubc9共转染24小时(B类)FLAG-Dnmt3a和GFP-PIAS1或(C类)FLAG-Dnmt3a和GFP-PIASxα。用（A）中的抗Ubc9抗体或（B–C）中的反FLAG-M2抗体进行免疫荧光标记，然后用材料和方法中描述的适当的二级抗体进行培养。使用配备有100×1.35 NA油浸物镜的Olympus IX70倒置显微镜收集图像。这两幅图像在最右边的面板中合并，黄色表示共同定位。方框区域被放大并显示在每个覆盖面板的右下角。右下面板中的比例尺对应于5µm。

图5
Dnmt3a被酰化体内和*在体外*. (A类)将GAL4-DBD标记的Dnmt3a（2μg）与SUMO-1表达载体（1.5μg）联合转染到COS-7细胞中。在NEM存在下制备全细胞提取物（WCE），并用抗GAL4-DBD抗体进行western blotting测定转染Dnmt3a的迁移位置（左面板）。用兔多克隆GAL4-DBD抗体（'r'）从转染的WCE中免疫沉淀Dnmt3a，用小鼠单克隆GAL4-DBD抗体通过western blotting测定GAL4-Dnmt3a总库的分子量（'m'，中间板）。“+SUMO-1”车道上存在迁移速度较慢的Dnmt3a，表明Dnmt3a已被磺化。当剥离印迹并用SUMO-1抗体进行再验证时，只能检测到迁移速度较慢的物种，并且这些分子量较高的形式在“+SUMO-1”反应中特别富集（右图）。(B类)Dnmt3a被酰化*在体外*.体外酰亚胺化反应是在³⁵标有S的*在体外*转录/翻译（IVT）Dnmt3a、200 ng重组SAE1/SAE2、1µg Ubc9、2 mM ATP、ATP再生系统和10µg SUMO-1或5µg GST-SUMO-1，如每块面板顶部所示。分子量标记（kDa）如左图所示。开放箭头表示未修改的GAL4-Dnmt3a的位置，填充箭头表示sumo修改的Dnmt3a的迁移位置。

图6
PIAS1和PIASxα不增强Dnmt3a的sumoylation体内或*在体外*. (A类)将两微克全长GAL4-Dnmt3a转染到COS-7细胞中，不使用（第1道）或使用1.5微克SUMO-1表达载体（第2道），并制备全细胞提取物，用于抗GAL4-DBD抗体的西方分析。在通道3和4中，分别用SUMO-1和GAL4-Dnmt3a表达载体共同转染四微克PIAS1或PIASxα表达载体。(B类)体外含有³⁵如图5B所述，用重组GST-PIASxα（1，5，10µg）补充S-标记的IVT Dnmt3a，并在6%SDS-PAGE凝胶上分析反应产物。

图7
Sumoylation对涉及Dnmt3a的几种已知蛋白质-蛋白质相互作用有不同的影响。(A类)将顶部列出的每个表达结构的2.0µg转染HCT116细胞24小时。制备全细胞提取物，并用小鼠抗GAL4-DBD标记抗体进行免疫沉淀，以下拉Dnmt3a。随后用抗HDAC1（左面板）或HDAC2（右面板）抗体进行的western blotting显示，Dnmt3a与HDAC1和HDAC2都相互作用，并且在有利于Dnmt3a sumoylation的条件下，这种相互作用显著减少（联合转染1.5µg SUMO-1表达载体）。HDAC1/2和GAL4-Dnmt3a的水平不受SUMO-1过度表达的影响（下两个面板，“输入”）。(B类)用标记的Dnmt3a和Dnmt2b1以及如上所述制备的全细胞提取物转染HCT116细胞。用抗GAL4-DBD抗体进行免疫沉淀，用抗FLAG抗体对结合材料进行免疫印迹，以检测Dnmt3b1的存在。SUMO-1的表达没有改变Dnmt3a与Dnmt2b1相互作用的能力（上面板），也没有影响转染蛋白的水平（下两面板，“输入”）。使用COS-7细胞（未显示）获得了类似的结果。

图8
Dnmt3a的SUMO-1修饰消除了其抑制转录的能力。(A类)全长Dnmt3a与GAL4-DBD融合时抑制转录。将越来越多的GAL4-Dnmt3a（0.5、1.0、2.5、5.0µg）或未醚化的Dnmt3a（0.5、1.0,2.5、5.0μg）与10 ng SV40共同转染到HCT116细胞中（以黑色楔子表示）-*雷尼利亚*荧光素酶构建体（用于控制转染效率）和1.0µg由五个GAL4 DNA结合位点驱动的萤火虫荧光素酶报告基因。萤火虫和*雷尼利亚*24小时后，使用Promega双荧光素酶测定试剂盒测量相同全细胞提取物制剂的荧光素瘤酶活性。(B类)将GAL4-Dnmt3a（4.0μg）与越来越多的SUMO-1表达载体（1.0、2.5、5.0、8.0μg）共同转染到HCT116细胞中。在不含GAL4-Dnmt3a的情况下转染等量的SUMO-1表达载体不会改变启动子活性。(C类)PIAS蛋白对Dnmt3a转录抑制的影响。将GAL4-Dnmt3a（4.0μg）与越来越多的PIASxα或PIAS1表达载体（1.0、2.5、5.0、8.0μg）或删除的PIAS1突变形式（Δ341-536、2.5、5.0,8.0µg）共同转染到HCT116细胞中，并在24小时后测定报告活性不含GAL4-Dnmt3a的表达质粒不会影响报告基因的活性。所有值均归一化为转染效率（萤火虫荧光素酶/*雷尼利亚*萤光素酶），然后相对于单独设置为100%的5×。值是两个独立实验的平均值，误差条是范围。通过添加“空”亲本表达载体，每次转染中的总DNA含量保持不变。

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