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.2004年2月；24（3）：976-84。
doi:10.1128/MCB.24.3.976-984.2004。

丝氨酸18磷酸化调节小鼠不同的p53功能

Hayla K Sluss公司 1, 希瑟·阿玛塔, 朱迪·格兰特, 斯蒂芬·琼斯
附属公司

丝氨酸18磷酸化调节小鼠不同的p53功能

Hayla K Sluss公司等。 分子细胞生物学. 2004年2月.

摘要

p53蛋白在DNA损伤或癌基因激活时通过诱导细胞周期阻滞和凋亡发挥抑癌作用。最近，有人提出，人类p53中丝氨酸15的磷酸化通过ATM（共济失调毛细血管扩张症突变）激酶通过干扰Mdm2-p53复合物的形成和抑制Mdm2-介导的p53失稳来诱导p53活性。小鼠p53中的丝氨酸18与ATM和共济失调毛细血管扩张相关激酶依赖性生长停滞有关。为了进一步探讨Ser18上p53磷酸化的生理意义，我们制作了p53发生丝氨酸-丙氨酸突变的小鼠。DNA损伤后胸腺细胞和脾细胞的凋亡分析表明，丝氨酸18的磷酸化是p53介导的强大凋亡所必需的。令人惊讶的是，p53Ser18磷酸化并没有改变胚胎成纤维细胞的增殖速度或由DNA损伤引起的p53介导的G（1）阻滞。此外，p53Ser18磷酸化不影响内源性基础水平和DNA损伤诱导的p53水平。p53Ala18小鼠发育正常，不易发生自发性肿瘤，p53Ala18的凋亡功能降低并不能挽救Mdm2-null小鼠的胚胎致死表型。这些结果表明，p53上ATM靶点的磷酸化可特异性调节p53的凋亡功能，并进一步揭示p53介导的肿瘤抑制不需要p53丝氨酸18的磷酸化。

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数字

图1。
图1。
p53基因丝氨酸18突变。（A） 靶向载体在外显子2中编码丝氨酸到丙氨酸的错义突变。安Xho公司作为诊断标记，该外显子中的I限制性位点也被删除。一条鞭子新第页在内含子1中引入该基因以允许ES细胞的阳性选择。说明了靶向载体在ES细胞中的同源重组。这个新由于PC3 ES细胞中存在原胺-Cre转基因的表达，嵌合小鼠精子中的基因将被切除。p53Ala18等位基因显示在底部。显示了用于Southern blot分析的探针（阴影框）。（B） 用5′外部探针对靶向ES细胞DNA进行Southern blot分析（左面板）。生态ES细胞DNA的RI消化表明存在突变等位基因（未切除新第页基因，6kb）和野生型等位基因（14kb）。F的Southern blot分析1带有EX7探针的后代（右侧面板）。安平均II digest区分野生型等位基因（4kb）、未删减的突变等位基因和删减的变异等位基因。（C） 通过外显子2的PCR扩增和Xho公司我限制网站。（D） p53第2外显子突变图。丝氨酸18突变为丙氨酸。相邻的Xho公司出于诊断目的，我删除了限制站点。
图1。
图1。
p53基因丝氨酸18突变。（A） 靶向载体在外显子2编码丝氨酸到丙氨酸的错义突变。安Xho公司I限制性位点作为诊断标记也在该外显子中被删除。一条鞭子新第页将该基因导入内含子1以允许ES细胞的阳性选择。说明了靶向载体在ES细胞中的同源重组。这个新由于PC3 ES细胞中存在原胺-Cre转基因的表达，嵌合小鼠精子中的基因将被切除。p53Ala18等位基因显示在底部。显示了用于Southern blot分析的探针（阴影框）。（B） 用5′外部探针对靶向ES细胞DNA进行Southern blot分析（左面板）。生态ES细胞DNA的RI消化表明存在突变等位基因（未切除新第页基因，6kb）和野生型等位基因（14kb）。F的Southern blot分析1带有EX7探针的后代（右侧面板）。安平均II digest区分野生型等位基因（4kb）、未删减的突变等位基因和删减的变异等位基因。（C） 突变的存在是通过外显子2的PCR扩增和Xho公司我限制网站。（D） p53第2外显子突变图。丝氨酸18突变为丙氨酸。相邻的Xho公司出于诊断目的，我删除了限制站点。
图2。
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p53介导的凋亡在p53Ala18小鼠中是有缺陷的。（A） 子G分析1照射和未照射动物（8 Gy，治疗后8 h）胸腺细胞的含量。这个年轴表示单元格编号x个轴代表DNA含量。子G的百分比1每个样本都有单元格。野生型野生型。（B） 子G直方图1辐照和未辐照小鼠的DNA。对每种基因型的两只独立动物进行了三次分析。（C） CD4的时间进程+CD8（CD8）+受照射（8 Gy）小鼠和未受照射小鼠的概况。该图描绘了双阳性细胞。（D） 胸腺细胞对电离辐射的反应能力。从小鼠体内取出胸腺细胞，进行照射（8 Gy），并在不同时间（0、8、16和24 h）收获胸腺细胞。细胞被膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素、抗CD4抗体染色+和7AAD。给出的值是活菌群的平均值（annexin V-fluorescein isothiocyanate和7AAD阴性），并归一化为每个基因型未经处理的动物中活细胞的数量。（E） p53Ala18小鼠脾细胞凋亡减少。制备并电镀脾细胞（2×105单元格）。用8Gy照射细胞。电离辐射后7天测定细胞活力。这个x个轴表示时间（天）年axis代表相对于未照射对照细胞的生存能力。
图2。
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p53介导的凋亡在p53Ala18小鼠中是有缺陷的。（A） 子G分析1照射和未照射动物（8 Gy，治疗后8 h）胸腺细胞的含量。这个年轴表示单元格编号x个轴代表DNA含量。子G的百分比1每个样本都有单元格。野生型野生型。（B） 子G直方图1辐照和未辐照小鼠的DNA。对每种基因型的两只独立动物进行了三次分析。（C） CD4的时间进程+CD8（CD8）+受照射（8 Gy）小鼠和未受照射小鼠的概况。该图描绘了双阳性细胞。（D） 胸腺细胞对电离辐射的反应能力。从小鼠体内取出胸腺细胞，进行照射（8 Gy），并在不同时间（0、8、16和24 h）收获胸腺细胞。细胞被膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素、抗CD4抗体染色+和7AAD。给出的值是活菌群的平均值（annexin V-fluorescein isothiocyanate和7AAD阴性），并归一化为每个基因型未经处理的动物中活细胞的数量。（E） p53Ala18小鼠脾细胞凋亡减少。制备并电镀脾细胞（2×105单元格）。用8Gy照射细胞。电离辐射后7天测定细胞活力。这个x个轴表示时间（天）年轴表示相对于未照射的对照细胞的活力。
图3。
图3。
p53Ser18突变不会影响基础或电离辐射诱导的p53蛋白水平。西方分析辐照（20 Gy）和未辐照胸腺细胞提取物。在电离辐射处理后0 h（未辐照）或8 h制备提取物。α-管蛋白被用作Western blot的对照。野生型野生型。
图4。
图4。
（A） 野生型p53Ala18和p53-null MEF的增殖。（B） S期MEF百分比的直方图（治疗或未治疗）。用电离辐射处理MEF，并在辐照后15至18小时用溴脱氧尿苷脉冲。分析了三个独立的p53Ala18-MEFs系。（C） 对电离辐射后5和18小时采集的辐照（8 Gy）和未辐照野生型MEF以及p53Ala18 MEF提取物进行西方分析。α-管蛋白被用作Western blot的对照。
图5：。
图5：。
p53Ala18 MEF中未诱导永生。对两个独立的p53Ala18/Ala18 MEF进行3T3分析，并与p53Ala 18/+、MEF和p53-null MEF进行比较。
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参考文献

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