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.2003年9月；14（9）：3821-33。
doi:10.1091/mbc.e03-01-0860。 Epub 2003年6月13日。

有丝分裂中的组蛋白过乙酰化防止姐妹染色单体分离并产生染色体分离缺陷

丹妮拉·西米尼 1, 玛尔塔·马蒂乌佐, 莉莉亚娜·托洛桑塔奇, 弗朗西丝卡·迪拉西
附属公司

有丝分裂中的组蛋白过乙酰化防止姐妹染色单体分离并产生染色体分离缺陷

丹妮拉·西米尼等。 分子生物学细胞. 2003年9月.

摘要

核心组蛋白的翻译后修饰有助于推动染色质构象和致密化的变化。在此，我们通过在人类原代成纤维细胞有丝分裂前不久抑制组蛋白脱乙酰化酶来研究组蛋白脱羧化在有丝分裂过程中的作用。用高乙酰化组蛋白进入有丝分裂的细胞显示出与抗Ser 10磷酸化H3抗体反应性降低相关的染色质构象改变，有丝分裂染色体上蛋白磷酸酶1-delta的补充增加，着丝粒异染色质中异染色素蛋白1的缺失。有丝分裂前抑制组蛋白脱乙酰化会导致活细胞中染色体凝集缺陷和有丝分裂进程受损，这表明染色体凝集不当可能导致有丝分裂检查点激活。后期细胞的原位杂交分析表明存在染色质桥，这是由着丝粒分离后姐妹染色单体臂上的持续凝聚力引起的。因此，有丝分裂过程中出现的超乙酰化染色质会损害后期前阶段的正确染色体凝集，导致姐妹染色单体分辨力差。由单个或成对姐妹组成的滞后染色体也被高乙酰化组蛋白的存在诱导，这表明与异染色质蛋白1缺失相关的较少受约束的着丝粒组织可能促进动粒与来自两极的微管的附着。

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数字

图1。
图1。
去乙酰化酶抑制剂TSA短期治疗可降低有丝分裂细胞的有丝分裂指数并诱导组蛋白过乙酰化。（A） 用不同浓度的TSA处理异步生长的人成纤维细胞MRC-5细胞1小时（实心条）或7小时（方形条），并在Giemsa染色的载玻片上评估有丝分裂频率。该图报告了三个独立实验所得结果的平均值±SE。（B） 在存在1%二甲基亚砜（–TSA）或500 ng/ml TSA（+TSA）的情况下，7小时后固定的间期和有丝分裂（箭头）MRC-5细胞上Lys 9乙酰化H3组蛋白的免疫荧光检测。与500 ng/ml TSA孵育1小时后，也获得了类似的结果。棒材，5μm。（C） 用0.1%二甲基亚砜（对照）或500 ng/ml TSA（TSA）孵育1 h，或接受35 ng/ml诺卡唑18 h（NOC）或35 ng/ml诺卡唑18h和500 ng/ml TSA最后2 h（NOC+TSA），对MRC-5细胞的核蛋白进行抗Lys 9乙酰基H3免疫印迹。
图2。
图2。
Lys 9 H3乙酰化降低了免疫细胞化学制剂中抗Ser 10磷酸化H3抗体的反应性。（A） 用500 ng/ml TSA（+TSA）或0.1%DMSO（–TSA）处理7 h的MRC-5细胞中不同有丝分裂期的Ser 10磷酸化H3组蛋白的免疫荧光检测。第一行，对照培养物中的早期前期细胞（箭头）显示磷酸化H3染色。对照培养物中的第二行、中期（箭头）和后期（箭头）细胞表现出强烈的磷酸化H3反应性。TSA处理的培养物中的第三排和第四排，中期（箭头）和后期（箭头）细胞，其中磷酸化H3反应性降低。棒材，10μm。（B） 高倍镜下对MRC-5中期细胞进行磷酸化-Ser10 H3组蛋白免疫染色。显示了一个对照中期细胞（–TSA）和一个用500 ng/ml TSA处理1小时的细胞（+TSA）。棒材，5μm。请注意，抗体反应性仅限于染色单体的外围。
图3。
图3。
Lys 9 H3乙酰化降低有丝分裂细胞上抗Ser 10磷酸化H3抗体的反应性，而不影响MPM-2染色。（A） 用0.1%二甲基亚砜（–TSA）或500 ng/ml TSA处理7 h（+TSA）的中期MRC-5细胞上Ser 10磷酸化H3组蛋白和MPM-2表位的免疫荧光检测。TSA处理的细胞显示出清晰的MPM-2染色和无磷酸化H3反应性。棒材，5μm。（B） MPM-2阳性细胞phospo H3反应性分析。MRC-5细胞与0.1%二甲基亚砜（对照）或500 ng/ml TSA（TSA）孵育7小时，或接受35 ng/ml诺卡唑孵育7h（NOC），或35 ng/ml诺卡唑和500 ng/ml TSA孵育8h（NOC+TSA）。MPM-2阳性中期被分类为弱阳性（如图2B，+TSA）或阴性（如图3A，+TSA），用于眼睛的磷酸化H3染色。每个实验点大约有100次有丝分裂。
图4。
图4。
PP1-δ在含超乙酰化组蛋白的间期和有丝分裂染色质上募集。（A） 用0.1%二甲基亚砜（–TSA）处理1h或接受500 ng/ml TSA（+TSA）的间期MRC-5细胞进行PP1-δ的免疫荧光检测。在TSA处理的培养物中，PP1-δ抗体严重污染细胞核。棒材，10μm。（B） 用0.1%二甲基亚砜（–TSA）处理1 h或接受500 ng/ml TSA（+TSA）的MRC-5细胞有丝分裂染色体上PP1-δ的免疫荧光检测。TSA处理培养物的中期染色体显示出强烈的PP1-δ染色。棒材，5μm。
图5。
图5。
Lys 9 H3乙酰化不会干扰Ser 10 H3磷酸化。异步生长的MRC-5细胞（MRC-5）或同步化HeLa细胞（HeLa）中核蛋白的抗Ser-10磷酸化H3免疫印迹。将MRC-5细胞与0.1%DMSO（对照）或500ng/ml TSA孵育7小时1小时（1h TSA）或7小时（7hTSA），或者接受35ng/ml诺可唑孵育7小时（NOC）或35ng/ml诺可唑和500ng/ml TSA孵育7小时（NOC+TSA）。制备核蛋白，用抗Ser 10磷酸化H3抗体进行免疫印迹，并通过化学发光显示。HeLa细胞通过胸苷/蚜虫灵阻滞在S期同步化。在蚜虫精处理结束时（S期），在完全培养基中释放13h后（有丝分裂），或在完全培养液中释放13h-后，包括用500 ng/ml TSA处理最后1h（1h TSA）或7h（7h TSA”），制备核蛋白并用抗Ser 10磷酸化H3抗体进行免疫印迹。在MRC-5和HeLa细胞中，TSA后细胞内磷酸化H3组蛋白的水平没有显著变化。
图6。
图6。
当组蛋白在有丝分裂中保持乙酰化时，活细胞中的染色体凝集受损。用500 ng/ml TSA（+TSA）或0.1%DMSO（–TSA）处理表达H2B-GFP的PtK1细胞5小时，然后通过荧光显微镜观察H2B-GFP。不同有丝分裂阶段的细胞显示为：前期（Pro-）、前中期（prometa-）、中期（meta-）和末期（telo-）。在所有有丝分裂阶段，TSA处理细胞的染色体不太紧密，显示GFP低荧光区与球形荧光点交替出现。棒，5μm。
图7。
图7。
短时间接触TSA的细胞中，着丝粒处异染色质蛋白1的积累受损。（A） 使用2HP 1H5抗体和CREST血清对来自0.1%二甲基亚砜（–TSA）或500 ng/ml TSA（+TSA）处理7 h的培养物的PtK1中期细胞进行HP1α和动粒蛋白的免疫荧光检测。用DAPI（蓝色）对DNA进行复染。右栏显示CREST、HP1和DAPI染色的叠加。HP1在比对照细胞中CREST抗体定义的区域宽的着丝粒处检测到（顶部，中间面板）。在TSA处理的细胞中，着丝粒积累消失（底部，中间面板）。棒材，5μm。（B） 定量分析用0.1%二甲基亚砜（红色条）处理7小时或用500 ng/ml TSA处理1小时（白色条）或7小时（灰色条）的MRC-5和PtK1细胞的HP1荧光。所示值为动粒荧光强度的平均值+SE（按照材料和方法中的描述获得）。条形图上的数字表示每个实验条件下测得的动粒数。当学生将TSA处理的样本与其各自的对照进行比较时，p<0.001吨测试。
图8。
图8。
TSA处理的MRC-5细胞中的染色体分离缺陷源于姐妹染色单体分离缺陷。（A） 动粒免疫荧光检测和后期细胞DNA染色，显示滞后染色体或染色质桥。滞后染色体显示两对CREST信号（箭头所示）。染色质桥在桥的末端显示两个延伸的CREST信号（箭头）。棒材，5μm。（B） TSA处理后染色体分离缺陷诱导的定量分析。在DMSO和TSA处理的细胞中，滞后染色体被分类为显示一个CREST信号（单亲）或两个成对CREST信息（成对姐妹）。TSA处理细胞和DMSO处理细胞中的染色质桥分类如下：没有可识别的CREST信号（没有CREST信息）；在桥的另一端（CREST远端）有CREST信号；CREST信号沿着染色质桥（CREST中心）。该图显示了对DMSO处理的细胞中937个后期细胞和TSA处理的培养物中921个后期细胞进行评分的结果。由于没有观察到明显的差异，因此将TSA处理1小时和7小时的数据进行汇总。（C） 用TSA处理后的后期MRC-5细胞，用16号染色体特异性阿尔卑斯山探针（异硫氰酸荧光素，绿色）和1号染色体经典卫星探针（罗丹明，红色）进行荧光原位杂交。用DAPI（蓝色）对DNA进行复染。两条染色体的规则分布有望在每组分离的染色体（正常细胞）上发出两个绿色信号和两个红色信号。后期细胞上的一些染色质桥在连接染色质的两端显示两个延伸的红色（染色质1桥）或绿色（16号染色体桥）信号。在其他情况下，着丝粒信号与染色质桥（着丝粒桥）完全重叠。在TSA处理的细胞中对后期（519）进行评分，记录到11个染色质桥，涉及1号染色体或16号染色体。11例中有2例为着丝粒桥。
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参考文献

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