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.2003年4月；23(8):2953-68.
doi:10.1128/MCB.23.82953-2968.2003。

丝氨酸303的磷酸化是热休克因子1应激诱导SUMO修饰的先决条件

Hietakangas镇 1, 约翰娜·阿尔斯科格（Johanna K Ahlskog）, 安妮卡·M·雅各布森, 玛丽亚·海利索, 尼科·M·萨尔伯格, 卡琳娜·霍姆伯格, 安德烈·米哈伊洛夫, 乔尔马·J·帕尔维莫, 莉拉·皮尔卡拉, 利亚·西斯顿
附属公司

丝氨酸303的磷酸化是热休克因子1应激诱导SUMO修饰的先决条件

Hietakangas村等。 分子细胞生物学. 2003年4月.

摘要

热休克反应伴随着热休克蛋白（Hsps）的快速而强烈的上调，是一种高度保守的抵抗蛋白质损伤应激的保护机制。应激诱导热休克因子1（HSF1）主要在转录水平上调节热休克蛋白的诱导。激活后，HSF1三聚化，与DNA结合，集中在核应激颗粒中，并经历显著的多位点磷酸化，这与其转录活性相关。在本研究中，我们发现HSF1以应力诱导的方式被SUMO-1和SUMO-2修饰。赖氨酸298位于HSF1的调节结构域，与几个关键的磷酸化位点相邻，Sumoyalization在赖氨酸298上快速而短暂地增强。HSF1磷酸化位点突变体的Sumoylation分析表明，磷酸化缺陷的S303突变体在体内仍然没有SUMO修饰，而模拟S303磷酸化的突变体在体外促进HSF1的Sumoylation，表明K298 sumoyl化需要S303磷酸。利用S303/7磷酸特异性抗体进行磷酸肽定位和分析进一步支持了这一发现，这表明丝氨酸303是强热诱导磷酸化的靶点，对应于诱导的HSF1 sumoylation。HSF1和SUMO-1在核应激颗粒中的短暂磷酸化依赖性共定位为HSF1与SUMO之间严格调控的亚核相互作用提供了证据。

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数字

图1。
图1。
HSF1通过SUMO-1和SUMO-2进行热诱导改性。（A） 将空载体（模拟）或Myc标记的人HSF1（HSF1）与GFP融合的野生型或结合缺陷型SUMO-1（分别为SUMO-1 WT和SUMO-1 GA）瞬时转染人K562红白血病细胞，24小时后，细胞要么未经处理（C），要么在42°C下暴露于热休克1小时（HS）。用抗Myc抗体进行免疫沉淀，用抗SUMO-1抗体进行免疫印迹分析。输入用多克隆抗人HSF1抗体进行印迹。（B） HSF1 WT与空载体（模拟）、His-tagged SUMO-2和SUMO-1或GFP-fused SUMO-1共转染K562细胞。细胞未经处理（C）或暴露于42°C（HS）下15分钟的热休克。样品通过抗HSF1蛋白印迹法进行分析。使用Hsc70作为负载对照。（C） 过度表达标志性HSF1和野生型GFP-SUMO-1的K562细胞受到单独1小时热休克（HS）、热休克后3小时恢复（R）或使用20μM蛋白酶体抑制剂MG132（MG）进行5小时治疗。使用抗Flag抗体进行免疫沉淀，并按照面板A、IP、免疫沉淀所述对样品进行进一步分析；WB，蛋白质印迹。面板A和C右侧以及面板B左侧的数字是以千道尔顿为单位的分子质量。
图2。
图2。
赖氨酸298是HSF1体内主要的酰化位点。（A） 对HSF1的氨基酸序列进行分析，以确定与一致的SUMO-1修饰序列对应的可能的sumoylation位点。完全一致的序列基序用开放框标记（K91、K126和K298），部分一致的位点用阴影标记（K150、K162和K381）。（B） K→R突变体与K562细胞中的野生型GFP-SUMO-1共表达，并进行1h热休克，然后进行免疫沉淀分析，如图1A所示。突变体sumoylation强度的变化反映了个体实验之间的差异。野生型；免疫沉淀；WB、Western blot。右边的数字是以千道尔顿为单位的分子质量。（C） 人类HSF1（hHSF1）SUMO-1修饰序列与小鼠HSF1（mHSF1）、大鼠HSF1（rHSF1），鸡HSF1（cHSF1）和斑马鱼的比对斑马鱼HSF1（zHSF1），蛙式X·莱维斯HSF1（XHSF1）和果蝇D.黑腹果蝇HSF（DrHSF）。SUMO-1共有序列在各个物种中装箱。利用ClustalW多序列比对进行比对。
图3。
图3。
丝氨酸303磷酸化位点突变为丙氨酸可阻止HSF1的酰化。（A） 示意图显示了K298（▿）在HSF1调控域中靠近几个关键磷酸化位点（星号）的位置。显示了DNA-结合域（DBD）、N-末端亮氨酸拉链（HR-A/B）、调节域（RD）、C-末端亮氨酸链式（-C）和激活域（AD）。（B） HSF1磷酸化位点的Myc-tagged S→A突变体与GFP-SUMO-1共转染到K562细胞中，然后进行1h热休克，细胞裂解物通过SDS-PAGE进行解析。用抗HSF1抗体进行Western blot分析，检测与sumoylated HSF1相对应的高分子量HSF1带的存在。抗Hsc70免疫印迹证实负载量相等。野生型；WB、Western blot。右边的数字是以千道尔顿为单位的分子质量。
图4。
图4。
S303在野生型和S307A突变型HSF1中被强烈磷酸化。为了获得二维胰蛋白酶磷酸肽图谱，将野生型（WT）、S303A、S307A或S303/7A HSF1转染到K562细胞中，然后在体内用[32P] 正磷酸盐，并暴露于热冲击（42°C，1小时）。标记的HSF1用胰蛋白酶消化并通过二维绘图解析。白色箭头表示在S303和S307上磷酸化的磷酸肽。黑色箭头表示在S303或S307上磷酸化的磷酸肽。起点表示为“x”
图5：。
图5：。
磷酸化S303/7特异性抗体的特征。（A） 对K562细胞进行热休克（HS；42°C下1小时）或不处理（C），用SDS-PAGE溶解细胞裂解物并用抗p-S303/7-HSF1抗体进行印迹。通过将抗体与过量500 M的游离磷酸肽预孵育来验证特异性（右图）。（B） 用Myc标记的野生型HSF1、S303A、S307A或S303/7A转染K562细胞，并在42℃下对细胞进行1h热休克。HSF1用抗Myc抗体免疫沉淀，免疫沉淀用SDS-PAGE溶解并用抗p-S303/7-HSF1抗体印迹。通过用抗HSF1抗体印迹细胞膜来控制等量的HSF1。（C）热休克因子1−/−用空质粒（模拟）、野生型HSF1或K298R突变体转染MEF。将细胞暴露于1h热休克下，用SDS-PAGE溶解细胞裂解产物，并用抗p-S303/7、抗HSF1和抗Hsc70抗体进行印迹。（D） 按照指示处理K562细胞，将细胞裂解物与免疫前血清（Pre）或磷酸化S303/7-HSF1或总HSF1特异性抗体预先孵育。通过凝胶迁移率变化分析HSE结合HSF1复合物。CHBA，构成性HSE结合活性；NS，非特异性蛋白-DNA相互作用；野生型；免疫沉淀；WB、Western blot。
图6。
图6。
S303/7的磷酸化与HSF1的琥珀酰化同时发生。（A） 用Myc标记的野生型HSF1和GFP-SUMO-1共同转染K562细胞，并在指定的时间段内进行热休克。细胞裂解产物用SDS-PAGE溶解，并用抗HSF1抗体进行免疫印迹分析，以确定HSF1的sumoylation水平。抗Hsp90免疫印迹法证实负载量相等。（B） 用单克隆抗HSF1抗体从与A组相同的样品中免疫沉淀HSF1，用SDS-PAGE溶解免疫沉淀，并用抗p-S303/7-HSF1和抗HSF1的抗体进行免疫印迹。（C） 将Myc标记的野生型HSF1、S303/7A或S303/7D与GFP-SUMO-1共转染到K562细胞中，然后在42°C下进行15分钟的热休克。细胞裂解产物用SDS-PAGE溶解，并用抗HSF1抗体进行免疫印迹分析。抗Hsp90免疫印迹法证实负载量相等。野生型；WB、Western blot；IP，免疫沉淀。面板A和C右侧的数字是以千道尔顿为单位的分子质量。
图7。
图7。
HSF1 S303/7D在体外优先被酰化。在vitro-translated中，35如图所示，在存在或不存在GST-Ubc9的情况下，将S标记的HSF1突变体和雄激素受体（AR）与纯化的GST-SUMOGG-1（SUMO-1）或GST-SAE1/GST-SAE2（SAE1/SAE2）孵育。反应产物通过SDS-PAGE进行解析，信号通过荧光成像进行可视化。随着缓慢迁移带的出现，检测到Sumoylation。WT，野生型。
图8。
图8。
野生型和K298R HSF1同样能很好地挽救热冲击响应热休克因子1−/−MEF公司。（A） 对热休克因子1−/−转染野生型或K298R突变型HSF1的MEF未经处理（C）或遭受1小时热休克（HS）。输入的裂解产物通过SDS-PAGE进行解析，并用抗HSF1和抗Hsc70抗体进行印迹（下面板）。（B）热休克因子1−/−用空载体（模拟）或野生型或K298R突变型HSF1转染MEF，不进行处理（C），或进行1h热休克（HS）或1h热冲击，然后进行3h恢复（R）。用抗HSF1和抗Hsp70抗体进行Western blotting分析热休克反应的诱导。抗-Hsc70抗体用于负荷控制。右侧面板显示了在没有HSF1（模拟）的情况下缺乏Hsp70诱导。野生型；WB，蛋白质印迹；CHBA，构成性HSE结合活性。
图9：。
图9：。
HSF1和SUMO-1在热休克反应开始时暂时形成小颗粒。（A） （上面板）HeLa细胞瞬时转染HSF1-Myc，并在42°C下热休克15分钟或不处理（C）。用抗p-S303/7抗体对甲醇固定细胞进行双重染色，检测磷酸化HSF1和抗Myc抗体定位总HSF1。免疫染色用荧光显微镜分析。在合并的图像中，彩色化可以被视为黄色。DAPI用于核染色。（下面板）HeLa细胞瞬时转染HSF1-Myc，并在42°C下热休克15分钟。在存在或不存在150μg重组人HSF1（rHSF1）（17）/ml的情况下，用抗p-S303/7和抗HSF1抗体对细胞进行双重染色。用单克隆抗Myc抗体结合红色荧光二级抗体检测HSF1，绿色通道显示GFP-SUMO-1。（C） 将S303A或K298R HSF1突变体与GFP-SUMO-1瞬时转染HeLa细胞。细胞在42°C下热休克15分钟，并按上述方法进行分析。
图9：。
图9：。
HSF1和SUMO-1在热休克反应开始时暂时形成小颗粒。（A） （上图）用HSF1-Myc瞬时转染HeLa细胞，并在42°C下热休克15分钟或不处理（C）。用抗p-S303/7抗体对甲醇固定细胞进行双重染色，检测磷酸化HSF1和抗Myc抗体定位总HSF1。免疫染色用荧光显微镜分析。在合并的图像中，彩色化可以被视为黄色。DAPI用于核染色。（下面板）HeLa细胞瞬时转染HSF1-Myc，并在42°C下热休克15分钟。在存在或不存在150μg重组人HSF1（rHSF1）（17）/ml的情况下，用抗p-S303/7和抗HSF1抗体对细胞进行双重染色。用单克隆抗Myc抗体结合红色荧光二级抗体检测HSF1，绿色通道显示GFP-SUMO-1。（C） 将S303A或K298R HSF1突变体与GFP-SUMO-1瞬时转染HeLa细胞。细胞在42°C下热休克15分钟，并按上述方法进行分析。
图9：。
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HSF1和SUMO-1在热休克反应开始时暂时形成小颗粒。（A） （上面板）HeLa细胞瞬时转染HSF1-Myc，并在42°C下热休克15分钟或不处理（C）。用抗p-S303/7抗体对甲醇固定细胞进行双重染色，检测磷酸化HSF1和抗Myc抗体定位总HSF1。免疫染色用荧光显微镜分析。在合并的图像中，彩色化可以被视为黄色。DAPI用于核染色。（下面板）HeLa细胞瞬时转染HSF1-Myc，并在42°C下热休克15分钟。在存在或不存在150μg重组人HSF1（rHSF1）（17）/ml的情况下，用抗p-S303/7和抗HSF1抗体对细胞进行双重染色。用单克隆抗Myc抗体结合红色荧光二级抗体检测HSF1，绿色通道显示GFP-SUMO-1。（C） 将S303A或K298R HSF1突变体与GFP-SUMO-1瞬时转染HeLa细胞。细胞在42°C下热休克15分钟，并按上述方法进行分析。
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参考文献

    1. Appella，E.和C.W.Anderson。2001.基因毒性应激对p53的翻译后修饰和激活。欧洲生物化学杂志。268:2764-2772.-公共医学
    1. Ben-Neriah，Y.2002年。免疫系统中泛素化的调节功能。自然免疫学。3:20-26.-公共医学
    1. Bies，J.、J.Markus和L.Wolff。SUMO-1蛋白与c-Myb转录因子负调控域的共价连接改变了其稳定性和反式激活能力。生物学杂志。化学。277:8999-9009.-公共医学
    1. Chu，B.、F.Soncin、B.D.Price、M.A.Stevenson和S.K.Calderwood。1996.丝裂原活化蛋白激酶和糖原合成酶激酶3的顺序磷酸化抑制热休克因子-1的转录激活。生物学杂志。化学。271:30847-30857.-公共医学
    1. Chu，B.，R.Zhong，F.Soncin，M.A.Stevenson和S.K.Calderwood。1998年。通过糖原合成酶激酶3和蛋白激酶Cα和Cζ对两种不同的丝氨酸残基进行磷酸化，37°C下热休克因子1的转录活性受到抑制。生物学杂志。化学。273:18640-18646.-公共医学

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