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.2003年2月18日；100(4):2029-34.
doi:10.1073/pnas.252782799。 Epub 2003年2月10日。

酸敏感离子通道-1的cAMP依赖性蛋白激酶磷酸化调节其与与C-激酶-1相互作用的蛋白质的结合

索伦·伦纳德 1, 奥列娜·耶尔莫莱耶娃, 阿莱西亚·赫鲁斯卡·哈格曼, 坎迪斯·C·阿斯奎斯, 玛格丽特·普莱斯, 约翰·A·威米, 迈克尔·J·威尔士
附属公司

酸敏感离子通道-1的cAMP依赖性蛋白激酶磷酸化调节其与与C-激酶-1相互作用的蛋白质的结合

索伦·伦纳德等。 美国国家科学院程序. .

摘要

酸感应离子通道-1（ASIC1）有助于突触可塑性，并可能影响对脑缺血和酸中毒的反应。我们发现cAMP依赖性蛋白激酶磷酸化脑片中异源表达的ASIC1和内源性ASIC1。ASIC1在基础条件下也表现出显著的磷酸化。先前的研究表明，ASIC1的极端C末端残基结合与C激酶-1（PICK1）相互作用的蛋白质的PDZ结构域。我们发现ASIC1C末端Ser-479的蛋白激酶A磷酸化干扰PICK1结合。相反，最小化磷酸化或将Ser-479突变为Ala可增强PICK1结合。PICK1结合的磷酸化依赖性破坏降低了ASIC1和PICK1的细胞共定位。因此，ASIC1C末端包含两个影响其与PICK1结合的位点。通过磷酸化调节这种相互作用提供了一种机制来控制ASIC1的细胞定位。

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数字

图1
图1
ASIC1和ASIC3的C末端是PKA的底物。(A类)亲和纯化的ASIC1/C-term固定在Ni上2+琼脂糖珠在体外激酶测定[32P] ATP和PKA、PKC或CaMKII（通道1-3），或省略激酶（通道4）。ASIC2的C端（ASIC2/C端）和ASIC3（ASIC3/C端）也用PKA进行了测试（车道6和7）。放射自显影术(上部)考马斯染色(下部)如图所示。(B类)ASIC1的细胞内C末端包含保守的PKA磷酸化位点Ser-479和C末端的PICK1相互作用位点。显示第二个跨膜结构域。显示了24-aa ASIC1/PEP的位置。(C类)对于在体外用突变为丙氨酸的Ser-478（ASIC1/PEP-S478A）或Ser-479（ASIC1/1PEP-S479A）合成PKA、PKC或CaMKII、24-aa肽的激酶分析。肽在N末端生物素化，并固定在链霉亲和素涂层板上，用于在体外激酶分析。量化后32闪烁计数P掺入，结果绘制为绝对cpm(n个=9，误差条为SD）。
图2
图2
PKA磷酸化ASIC1的Ser-479。(A类)所示全长ASIC1蛋白从转染的COS-7细胞中溶解，免疫纯化，作为PKA底物进行检测[32P] ATP，用SDS/PAGE分离。GFP作为附加控制。(A–C上部)自动射线照片。(A–C下部)ASIC特异性抗体的免疫印迹。(B类)用10μM forskolin和100μM IBMX、1μM KT5720或载体处理转染有指定结构的细胞，并通过反磷酸化检测PKA依赖性磷酸化(n个= 3). (C类)ASIC1从用载体、10μM毛喉素和100μM IBMX、1μM KT5720或10μM二脱氧毛喉素处理的小鼠脑切片中进行免疫纯化，并通过反向磷酸化进行检测以检测PKA依赖性磷酸化。使用免疫前血清控制免疫沉淀（7–8道）(n个= 3).
图3
图3
ASIC1的PKA磷酸化减少PICK1结合。(A类)在COS-7细胞中共表达全长ASIC1和PICK1，并用1μM KT5720或10μM forskolin和100μM IBMX处理。免疫沉淀ASIC1，然后用凝胶进行PICK1免疫印迹(上部)或ASIC1(下部). 用免疫前血清进行对照免疫沉淀。(B类)PICK1免疫信号的定量(n个=3，误差条为SD）。(C类)亲和纯化的ASIC1/C-term（2μg）与PKA在不存在（−）或存在（+）1mM ATP的情况下孵育，然后测试与1μM纯化的PICK1的结合。如图所示，PICK1-结合分析中包括ASIC1/PEP（10μM）。样品用PICK1进行免疫印迹(上部)或ASIC1(下部)抗体。(D类)GluR2和ASIC1之间的序列比对。方框区域显示保守氨基酸，箭头表示PKA磷酸化位点S479。(E类)亲和纯化的ASIC1/C-term被固定用于在体外与纯化PICK1的结合分析。添加ASIC1/PEP作为PICK1结合抑制剂（填充方块）。作为对照，ASIC1/PEP用PKA预磷酸化，PKA失活，然后在10μM（开平方）下添加。作为附加控制，ASIC3/PEP添加到10μM（实心圆）。
图4
图4
ASIC1的PKA磷酸化减少了与PICK1的共定位。(A类)澳大利亚证券投资委员会1(上部)或ASIC1-S479A(下部)在COS-7细胞中与PICK1共表达，并通过荧光显微镜进行活体成像。(B类)在同一细胞中用10μM forskolin和100μM IBMX处理（−）和（+）20分钟后计算共定位百分比。细胞由盲法观察者选择，共定位百分比由METAMORPH软件确定，并为重叠区域设置参数(n个=50，误差条为SD）。
图5
图5
ASIC1的PKA磷酸化减少海马神经元的聚集。(A类)用ASIC1转染大鼠海马神经元(左侧)或ASIC1-S479A(赖特). 之前用荧光显微镜对神经元进行了实时成像(上部)20分钟后(下部)添加1μM KT5720。(插图)扩大装箱区域。(B类)在同一细胞中添加1μM KT5720之前（−）和之后20分钟（+）计算相对聚集强度。每个神经元共有30个簇用METAMORPH软件进行分析(n个=3，误差条为SD）。图像被阈值化以定义簇。相对聚类强度是聚类强度与直接背景的比值。
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    1. Welsh M J、Price M P、Xie J.J生物化学。2002;277:2369–2372.-公共医学
    1. Waldmann R、Champigny G、Bassilana F、Heurteaux C、Lazdunski M、Nature。1997;386:173–177.-公共医学
    1. García-añoveros J、Derfler B、Neville-Golden J、Hyman B T、Corey D P.美国国家科学院院刊1997；94:1459–1464.-项目管理咨询公司-公共医学

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