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。2003年1月；23(1):140-9.
doi:10.1128/MCB.23.140-149.2003。

激活信号协整器2属于一种新的稳态复合物，它包含三胸类蛋白的子集

Young-Hwa Goo公司 1, 年轻的张松, 金大焕, Seung-Whan Kim先生, 闵荣康, 董菊君, 尤妮·夸克, 尼科莱·A·巴列夫, 雪莱·L·伯杰, 文森特·周, 罗伯特·G·罗德, 大卫·O·阿索萨, 保罗·S·梅尔泽, Pan-Gil Suh公司, 恩珠颂, 孔佐利（Kong-Joo Lee）, 年轻的Chul Lee, 李在云（Jae Woon Lee）
附属公司

激活信号协整器2属于一种新的稳态复合物，它包含三胸类蛋白的子集

Young-Hwa Goo公司等。 分子细胞生物学。 2003年1月。

摘要

许多转录辅激活子以配体和C末端反式激活功能（AF2）依赖的方式与核受体相互作用。其中包括激活信号协整因子2（ASC-2），这是一种最近分离的转录辅激活因子分子，在人类癌症中被放大，并通过核受体和许多其他转录因子刺激反式激活。在本报告中，我们表明ASC-2属于HeLa核中约2 MDa的稳态络合物（ASC-2络合物[ASCOM]）。ASCOM包含视网膜母细胞瘤结合蛋白RBQ-3、α/β-微管蛋白和三胸类蛋白ALR-1、ALR-2、HALR和ASH2。特别是，ALR-1/2和HALR包含一个高度保守的130到140氨基酸基序，称为SET结构域，最近与组蛋白H3赖氨酸特异性甲基化活性有关。事实上，重组ALR-1、HALR和免疫纯化ASCOM在体外表现出非常微弱但特异的H3-赖氨酸4甲基化活性，维甲酸受体的反式激活似乎涉及ASCOM的配体依赖性募集和体内启动子区随后的短暂H3-赖胺酸4甲基化合作。因此，ASCOM可能代表核受体的一种独特的辅活化复合物。ASCOM的进一步表征将有助于更好地理解核受体和其他转录因子如何介导转录激活。

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数字

图1。
图1。
ASCOM的纯化。（A） 显示了从核提取物（HeLa NE）中纯化ASCOM的色谱方案。数字和括号分别表示KCl摩尔浓度和熔池。αASC-2、抗ASC-2。（B） 多肽的质谱鉴定。抗-ASC-2抗体柱洗脱液在SDS-12%PAGE凝胶上运行，银染，并通过MALDI-TOF进行分析，基因产物和分子量（括号内）显示在右侧。标记蛋白（M）的质量如左图所示，星号表示非特异性带。针对AC22148（一种功能未知的蛋白质）的抗体显示，它是一种非特异性污染物。MALDI-TOF质谱分析未能揭示约116 kDa蛋白质的身份（表示未知）。
图2。
图2。
确认ASCOM组件的身份。（A） 用ASC-2、CBP、SRC-1和hMed6的指示抗体对HiTra Q柱部分进行Western分析。FT，流通；fr#，分数。（B） 将HiTrap Q组分40至44与抗ASC-2（αASC-2）抗体混合并免疫沉淀（IP），并用所示抗体分析Western（W）。αCBP，抗CBP；αSRC-1，抗SRC-1；αSRC-2，抗SRC-2。（C） 根据纯化蛋白质的MALDI-TOF质谱数据分离的cDNA编码的合成或重组多肽产生抗体。+和−，分别含有来自HeLa核提取物的ASCOM的HiTrap Q组分（40至44组分）和不相关组分（30至34组分）。每种抗体识别一种具有预期分子量（MW）（以千计）的蛋白质。αALR，抗ALR；αHALR，抗HALR；αASH2，抗ASH2；αRBQ-3，抗RBQ-3。用指示抗体（IP）免疫沉淀含有ASCOM的HeLa核提取物的（D、E和F）HiTrap Q组分（40至44组分），用SDS-4至6.5%PAGE分离，并用指示抗体进行探测（W）。αHA，抗HA；αBRG1，抗BRG1。S和S表示上清液，P和P表示沉淀。将总反应混合物的10%作为输入。
图3。
图3。
ASCOM中的α/β-管蛋白。（A） 对于ASCOM的粒度分级，将HiTrapQ组分40至44（如图2A所示）加载到Mono S柱上（HR5/5；Pharmacia）。将免疫反应组分合并，应用于Superose 6柱（HR10/30；Pharmacia），并按指示通过免疫印迹分析。fr#，分数；W、 西方分析；αHALR，抗HALR；αASC-2，抗ASC-2；αASH2，抗ASH2；αRBQ-3，抗RBQ-3。（B和C）用指示抗体（IP）免疫沉淀含有ASCOM或约500kDa的较小复合体的超6组分9（B）或28（C），用SDS-4至6.5%PAGE分离，并用指示抗体进行探测（W）。S和P分别表示上清液和沉淀。将总反应混合物的10%作为输入。αPIPKIβ，抗PIPKI。（D） 用β-微管蛋白、BRCA1和ASC-2抗体处理细胞。分别用荧光素异硫氰酸酯（绿色）和四甲基罗丹明异硫氰酸酯（红色）结合抗体检测ASC-2和β-微管蛋白/BRCA1。注意ASC-2和β-微管蛋白的共定位。α-微管蛋白抗体也获得了类似的结果（数据未显示）。驾驶员信息中心（DIC），差分干扰对比度。
图4。
图4。
HALR/ALR SET域。（A） ySET1、hTrx/ALL-1、hHALR和hALR-1的示意图。如图所示，各种已知的蛋白质基序都有颜色编码。（B） hHALR、hALR、dTrx（登录号AAF55041）、ySET1（登录号：AAB68867）、，S.pombe公司Clr4（登记号060016）、hG9a（登记号S30385）和hSUV39 h1（登记号NP_003164）。所有七种蛋白质中保守的氨基酸；单位为hHALR、hALR、dTrx和ySET1；在yClr4中，hG9a和hSUV39 h1分别以红色、绿色和蓝色突出显示。虚线表示路线中的间隙。红色和蓝色线分别标记SET域和后SET域的范围。将HR/SET1Δ中删除的四个残基的保守区装箱，并用星号标记HR/SET1m1中突变为丝氨酸的保守甘氨酸。
图5：。
图5：。
ASCOM检测H3结合和甲基化。（A） 将含有ASCOM的HiTrap Q柱馏分（图2A中的40至44馏分）与组蛋白偶联的琼脂糖珠或寡聚物（A）（Sigma）孵育，用SDS-7%PAGE分离，并用抗ASC-2（αASC-2）抗体（W）探测。s和p分别表示上清液和沉淀。将总反应混合物的10%作为输入。（B） GST下拉实验如前所述（17、19），仅使用GST或GST融合到H2A、H2B、H3和H4，并加载20%的总反应混合物作为输入。（C） 用所示抗体免疫沉淀含有ASCOM的HiTrap Q柱部分（40至44部分），并用牛血清白蛋白H3或H4测定甲基化活性。αHA、抗HA；αALR、抗ALR；αASH2，抗ASH2。
图6。
图6。
HALR测定的H3-K4特异甲基化。（A） HALR和三个HALR C末端缺失片段的示意图，带有四个PHD手指、一个HMG-like结构域和C末端SET结构域。组蛋白甲基转移酶活性通过游离组蛋白在S公司-腺苷-我-[甲基-三H] 蛋氨酸和结合放射性通过过滤器结合测定。（B） 组蛋白甲基转移酶活性通过在存在S公司-腺苷-我-[甲基-三H] 蛋氨酸和结合放射性通过过滤器结合测定。GST下拉实验如前所述（17、19），GST融合到人类H3（野生型[wt]）和点突变体的N末端57残基，并加载20%的总反应混合物作为输入。
图7。
图7。
在RAR交易中招募ASCOM。（A） 将视黄醇反应性β-RARE-LUC报告子构建物与HeLa细胞共转染lacZ公司表达载体（100 ng）和用于DN1（100 ng。封闭和阴影方框表示不存在0.1μM 9-顺式-维甲酸（RA）。计算三份样品的归一化荧光素酶表达与lacZ公司表达。CV-1细胞也获得了类似的结果（数据未显示）。（B和C）ASCOM招募到β-RARE和p21WAF1（加权平均1）和H3-K4甲基化。将RAR（10 ng）、DN1（100 ng）和DN1/m（100 ng-顺式-RA，如图所示。从这些细胞中分离出染色质，并用所示抗体进行免疫沉淀。内源性β-RARE或p21WAF1（加权平均1）免疫沉淀样品中存在的区域通过PCR扩增，输入PCR显示为负载对照。
图8。
图8。
HALR-SET抑制RAR转录激活。（A） 视黄醇反应性β-RARE-LUC报告子构建物与HeLa细胞共转染lacZ公司表达载体（100ng）和HR/SET1、HR/SET1m1和HR/SET1Δ的表达载体，如图所示。封闭和阴影框表示是否存在0.1μM的9-顺式-维甲酸（RA）。计算了三份样品的归一化荧光素酶表达，与lacZ公司表达。CV-1细胞也获得了类似的结果（数据未显示）。（B） 如前所述（17、19），使用GST单独或GST融合到人类H3的N末端57残基进行GST下拉实验，并加载20%的总反应混合物作为输入。
图9：。
图9：。
ASCOM功能的工作模型。配体结合后，核受体发生结构变化，这表明一系列不同的辅激活物复合物取代了辅抑制物复合物。图中显示了三种共激活物复合物，它们包含定义明确的基于LXXLL基序的适配器分子（SRC-1、ASC-2和PBP/TRAP220/DRIP205//TRIP2）。在不同的启动子环境和细胞条件下，这些和其他辅激活子可以选择性地招募到单个受体（见正文）。HALR/ALR的SET结构域可能直接或间接参与体内H3-K4和/或其他未知底物的甲基化。DN1竞争性地阻止受体招募ASCOM，而不是其他基于LXXLL的复合物，因此可以特异性地抑制ASCOM介导的启动子区H3-K4甲基化。
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