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。2002年11月25日；159(4):637-48.
doi:10.1083/jcb.200208013。 Epub 2002年11月18日。

p115半胱天冬酶裂解片段诱导高尔基体断裂和细胞凋亡

雷蒙德·邱 1, 列奥尼德·诺维科夫, 谢里·穆克吉, 丹尼斯·希尔兹
附属公司

p115半胱天冬酶裂解片段诱导高尔基体断裂和细胞凋亡

雷蒙德·邱等。 J细胞生物学。 。

摘要

在哺乳动物细胞中，高尔基体在凋亡过程中发生广泛的断裂。p115是维持高尔基体结构所需的关键囊泡栓系蛋白。在这里，我们证明p115在凋亡过程中被半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和8切割。与表达天然p115的对照细胞相比，那些表达抗劈裂型p115的细胞在凋亡过程中延迟了高尔基体的断裂。编码p115全长或NH2末端胱天蛋白酶切割片段的cDNA的表达对高尔基体形态没有影响。相反，p115的COOH末端胱天蛋白酶切割产物的表达本身导致高尔基体断裂。此外，该片段移位到细胞核，其表达足以诱导细胞凋亡。最重要的是，在caspase抑制剂存在的情况下，或在与p115抗裂解突变体共表达时，COOH末端片段的体内表达表明，p115降解在独立于高尔基体裂解放大凋亡反应中起着关键作用。

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数字

图1。
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细胞凋亡期间高尔基体的碎片与GM130磷酸化无关。用staurosporine或etoposide诱导NRK细胞凋亡12 h或24 h。然后对细胞进行免疫荧光显微镜检查，并使用针对磷酸化形式GM130（红色）的兔抗PS25抗体进行检查（Lowe等人，2000）。细胞核用Hoechst 33238（蓝色）染色。作为阳性对照，NRK细胞在有丝分裂时使用蚜虫灵进行同步（Lowe等人，2000）。请注意，磷酸化的GM130仅在有丝分裂细胞中出现。棒材，10μm。
图2。
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细胞凋亡过程中GM130和p115水平下降。p115被半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶切割成两个片段。（A） 用staurosporine或etoposide培养COS7细胞。在指定的时间，使用GM130、p115、PARP或高尔基SNARE、Vtila的抗体制备细胞裂解物进行Western blotting。p115抗体显示凋亡裂解物中有两种90和30 kD的多肽。（B） 葡萄孢霉素和足叶乙甙处理细胞中GM130和p115分解的定量以及90kD和30-kD多肽的出现。请注意，90-kD和30-kD多肽的出现与全长p115的减少相一致，表明存在前体-产物关系。（C） 用活化的抗Fas抗体和环己酰亚胺（C.+F.）处理HeLa细胞。在治疗24或48小时后制备细胞裂解物，并使用p115抗体通过Western blotting进行分析。与单独用放线菌酮处理的对照样品不同，用抗Fas抗体和放线菌亚胺孵育的细胞的p115水平降低。（D） 在存在z-VAD-fmk或z-YVAD-fmk的情况下，从用staurosporine或etoposide处理指定时间的COS7细胞制备裂解物。用p115抗体对裂解产物进行蛋白质印迹分析。凋亡半胱天冬酶抑制剂z-VAD-fmk的存在抑制了凋亡细胞裂解物中90-kD多肽的生成。
图2。
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细胞凋亡过程中GM130和p115水平下降。p115被半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶切割成两个片段。（A） 用staurosporine或etoposide培养COS7细胞。在指定的时间，使用GM130、p115、PARP或高尔基SNARE、Vtila的抗体制备细胞裂解物进行Western blotting。p115抗体显示凋亡裂解物中有两种90和30 kD的多肽。（B） 葡萄孢霉素和足叶乙甙处理细胞中GM130和p115分解的定量以及90kD和30-kD多肽的出现。请注意，90-kD和30-kD多肽的出现与全长p115的减少相一致，表明存在前体-产物关系。（C） 用活化的抗Fas抗体和环己酰亚胺（C.+F.）处理HeLa细胞。在处理后24或48小时制备细胞裂解物，并使用p115抗体通过蛋白质印迹进行分析。与单独用放线菌酮处理的对照样品不同，用抗Fas抗体和放线菌亚胺孵育的细胞的p115水平降低。（D） 在存在z-VAD-fmk或z-YVAD-fmk的情况下，从用staurosporine或etoposide处理指定时间的COS7细胞制备裂解物。用p115抗体对裂解产物进行蛋白质印迹分析。凋亡半胱天冬酶抑制剂z-VAD-fmk的存在抑制了凋亡细胞裂解物中90-kD多肽的生成。
图2。
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细胞凋亡过程中GM130和p115水平下降。p115被半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶切割成两个片段。（A） 用staurosporine或etoposide培养COS7细胞。在指定的时间，使用GM130、p115、PARP或高尔基SNARE、Vtila的抗体制备细胞裂解物用于蛋白质印迹。p115抗体显示凋亡裂解物中有两种90和30 kD的多肽。（B） 葡萄孢霉素和足叶乙甙处理细胞中GM130和p115分解的定量以及90kD和30-kD多肽的出现。请注意，90-kD和30-kD多肽的出现与全长p115的减少相一致，表明存在前体-产物关系。（C） 用活化的抗Fas抗体和环己酰亚胺（C.+F.）处理HeLa细胞。在治疗24或48小时后制备细胞裂解物，并使用p115抗体通过Western blotting进行分析。与单独用放线菌酮处理的对照样品不同，用抗Fas抗体和放线菌亚胺孵育的细胞的p115水平降低。（D） 在存在z-VAD-fmk或z-YVAD-fmk的情况下，从用staurosporine或etoposide处理指定时间的COS7细胞制备裂解物。用p115抗体对裂解产物进行蛋白质印迹分析。凋亡半胱天冬酶抑制剂z-VAD-fmk的存在抑制了凋亡细胞裂解物中90-kD多肽的生成。
图2。
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细胞凋亡过程中GM130和p115水平下降。p115被半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶切割成两个片段。（A） 用staurosporine或etoposide培养COS7细胞。在指定的时间，使用GM130、p115、PARP或高尔基SNARE、Vtila的抗体制备细胞裂解物进行Western blotting。p115抗体显示凋亡裂解物中有两种90和30 kD的多肽。（B） 葡萄孢霉素和足叶乙甙处理细胞中GM130和p115分解的定量以及90kD和30-kD多肽的出现。请注意，90-kD和30-kD多肽的出现与全长p115的减少相一致，表明存在前体-产物关系。（C） 用活化的抗Fas抗体和环己酰亚胺（C.+F.）处理HeLa细胞。在治疗24或48小时后制备细胞裂解物，并使用p115抗体通过Western blotting进行分析。与单独用放线菌酮处理的对照样品不同，用抗Fas抗体和放线菌亚胺孵育的细胞的p115水平降低。（D） 在存在z-VAD-fmk或z-YVAD-fmk的情况下，从用staurosporine或etoposide处理指定时间的COS7细胞制备裂解物。用p115抗体对裂解产物进行蛋白质印迹分析。凋亡半胱天冬酶抑制剂z-VAD-fmk的存在抑制了凋亡细胞裂解物中90-kD多肽的生成。
图3。
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p115在体外和体内被半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3在TEKD残基上裂解 757 生成90和30 kD碎片。（A） 将体外翻译的人p115 mRNA与各种半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶在37°C下孵育1小时。p115被纯化的caspase-3切割成四个片段，分别为90、75、50和30 kD。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8仅产生90和30 kD片段。（B） 体外翻译牛p115 mRNA与人p115相同的半胱天冬酶孵育。顶部的数字表示每个反应中caspase的浓度（nM）。（C） 体外翻译的人p115 mRNA与caspase-3孵育指定时间（min）。对于野生型p115（左），90和30 kD片段在培养10分钟后迅速生成。相反，75-kD和50-kD片段需要长时间培养才能达到稳定。对于p115 TEKD757阿拉突变体（右），90和30 kD片段的外观完全消失，而75和50 kD片段未受影响。星号表示p115的翻译产物不完整。（D） 用NH转染COS7细胞2-野生型p115或p115 TEKD的终端FLAG结构757阿拉突变体。转染24h后，用staurosporine或etoposide诱导细胞凋亡，诱导时间为指定时间。用多克隆FLAG抗体制备裂解液并通过Western blotting进行分析。野生型p115，与p115 TEKD不同757阿拉对突变体进行裂解，生成90-kD片段。（E） 用staurosporine、etoposide、环己酰亚胺（C.）或激动性抗Fas抗体加环己酰酮（C.+F.）处理MCF-7细胞指定时间。制备细胞裂解物，并使用p115和BID抗体进行Western blot分析。
图4。
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细胞凋亡过程中高尔基体形态的分类。（A） 将未经处理的COS7细胞（左）固定并用抗GM130单克隆抗体染色（绿色）。细胞核用Hoechst 33238（蓝色）染色。注意未处理细胞的核周高尔基染色很紧。足叶乙甙处理24小时后，区分出两组细胞。在一个群体（中间）中，高尔基体处于分裂早期，染色松散，但仍呈网状和核周。在第二个种群中，高尔基体完全分散，由此产生的膜碎片染色为点状结构（右）。（B） 野生型p115或p115 TEKD转染COS7细胞757阿拉用依托泊苷处理突变体24小时。然后如上所述对细胞进行染色和处理。p115 TEKD的表达757阿拉与表达野生型p115的对照细胞相比，突变体延迟了高尔基体断裂的两个阶段。棒材，10μm。
图5。
图5。
p115的COOH末端裂解片段诱导高尔基体裂解和凋亡。用FLAG标记的全长p115，NH转染COS7细胞2-末端片段（p1151–757)，或COOH末端片段（p115758–962). 转染后20 h固定细胞，并用TGN38（绿色）抗体、FLAG（红色）抗体和Hoechst 33238（蓝色）染色。全长p115和p1151–757主要定位于高尔基体区域，其表达不影响转染细胞中高尔基体形态或细胞活力。相反，p115758–962染色弥漫于细胞质，集中于细胞核。最重要的是，p115的表达758–962TGN38和Hoechst染色分别显示诱导高尔基体碎裂和凋亡。“单细胞”面板显示了用每个构建物转染的代表性细胞的放大合并图像。箭头表示转染细胞。棒材，10μm。
图6。
图6。
p115的COOH末端caspase裂解片段的表达诱导caspase激活和凋亡。（A） HeLa细胞与表达GFP和NH的载体共转染2-或p115的COOH-末端半胱天冬酶裂解片段。转染后24小时，处理细胞进行免疫荧光显微镜检查，并用Hoechst 33238（蓝色）和只识别PARP p85 caspase裂解片段（红色）的多克隆抗体染色。转染细胞通过GFP荧光（绿色）鉴定。表达p115 NH的细胞2-末端裂解片段未对裂解的PARP进行染色，核染色正常，与未转染细胞在形态学上无法区分（顶部）。与之形成鲜明对比的是，表达p115的COOH末端裂解片段的细胞对裂解的PARP呈阳性反应，并显示出其他凋亡特征，包括染色质凝聚和细胞收缩（底部）。（B） HeLa细胞按上述方法转染和处理。用Hoechst 33238（蓝色）和一种多克隆抗体对固定细胞进行染色，该抗体特异性识别活化caspase-3的p18亚单位，但不识别procaspase-2（红色）。转染细胞（绿色）表达COOH末端（底部），但不表达NH2-末端（顶部），p115的胱天蛋白酶切割片段被活化的胱天蛋白酶3抗体染色。箭头表示转染的细胞。棒材，10μm。
图7。
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p115的COOH末端caspase裂解片段独立诱导高尔基体裂解和凋亡。（A） 用DMSO单独（顶部）或z-VAD-fmk（底部）预处理COS7细胞，然后用标记的p115 COOH末端片段构建的FLAG转染。转染后20小时，细胞固定并用FLAG（红色）抗体、GM130（绿色）抗体和Hoechst 33238（蓝色）染色。用z-VAD-fmk预处理的转染细胞没有凋亡，但显示了广泛的高尔基体碎裂和COOH末端片段的核定位。（B） COS7细胞与带FLAG标记的p115 TEKD基因共转染757阿拉突变体和COOH末端p115片段的比率为10:1。细胞转染后20小时固定，并按上述方法染色。细胞凋亡（箭头）但显示正常高尔基体形态的共转染细胞明显存在。（C） 用缺乏酸性区域（p115 TEKD）的COOH末端片段的FLAG标记构建物转染细胞757–933)并如上所述进行染色。请注意，左侧（箭头）的转染细胞处于凋亡的早期阶段，右侧（箭头）细胞处于后期阶段。箭头表示转染（A和C）或共转染（B）细胞。棒材，10μm。
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