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.2002年4月29日；157(3):493-507.
doi:10.1083/jcb.200109100。 Epub 2002年4月22日。

整合素α（v）β8通过MT1-MMP依赖性激活TGF-β1调节上皮内稳态

德智慕 1, 斯蒂芬妮·坎比尔, 拉尔斯·杰尔伯克兰, 乔迪·L·拜伦, 约翰·S·芒格, 川崎骏, 迪安·谢泼德, V考特尼·布罗德斯, 斯蒂芬·西村
附属公司

整合素α（v）β8通过MT1-MMP依赖性激活TGF-β1调节上皮内稳态

德智慕等。 J细胞生物学. .

摘要

整合素、基质金属蛋白酶（MMPs）和细胞因子TGF-β均与细胞生长和基质重塑等稳态细胞行为有关。TGF-β主要以潜伏状态存在，体内稳态控制的一个主要点是TGF-α的激活。由于TGF-β1的潜在结构域具有整合素结合基序（RGD），整合素有可能将潜在的TGF-贝塔（SLC）隔离到细胞表面，在那里TGF-贝塔活化可以被局部控制。在这里，我们显示SLC与α（v）β8结合，α（v）β8是体内正常上皮细胞和神经元细胞表达的整合素。这种结合导致膜型1（MT1）-基质金属蛋白酶依赖性释放活性TGF-β，导致自分泌和旁分泌对细胞生长和基质生成的影响。这些数据阐明了通过协调参与细胞-基质相互作用的三个主要基因家族成员的活动来实现细胞内稳态的新机制。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
αvβ8以RGD-和阳离子依赖性方式与LAP-β1结合。（a）n个-辛基葡萄糖苷裂解物125将I-细胞表面标记的β8-表达HT1080细胞（1 ml）通过两个相同的LAP-β1–Sepharose柱（1 ml。一个柱用含有10 mM EDTA的1-ml组分（组分4-8）洗脱，另一个柱则用含有1 mg/ml GRGESNK（通道1'-3'）或1 mg/ml的GRGDSNK（区域4'-7'）的1-ml馏分洗脱。样品在非还原条件下通过7.5%SDS-PAGE进行分离，并通过放射自显影术进行可视化。（b） EDTA和RGD洗脱组分用抗β8（14E5）免疫沉淀，并与细胞裂解液中的抗αv（L230）和抗β8免疫沉淀进行比较。MW标记的迁移如左图所示，αv（150kD）和β8（90kD）亚基的预期迁移如右图所示。样品在非还原条件下通过7.5%SDS-PAGE进行分离，并通过放射自显影术进行可视化。（c）35将S代谢标记的截短分泌αvβ8-AP融合蛋白（Translabel and ICN Biomedicals）应用于0.5 ml的LAP-β1–Sepharose柱上，用六种洗涤缓冲液组分（第1道，最后一道洗涤部分）依次洗涤，然后用1 mg/ml GRGDSPK洗脱（第2–6道）。左边是MW标记的迁移，右边是截短的αv（140 kD）和截短的β8-AP（130 kD）亚单位的预期迁移。样品在非还原条件下用10%SDS-PAGE进行分离，并通过放射自显影术进行可视化。（d） 将含有分泌型截短αvβ8并带有COOH末端AP标记（AP-αvβ9）的上清液涂敷在涂有含有RGD或RGE结合基序的LAP-β1（10μg/ml）或涂有VN（100μg/ml。用比色法测定特异性结合。星号表示与抗体处理或LAP（RGE）对照组相比，受体与LAP（RGD）的结合增加(第页< 0.001). （e） 使用浓缩的AP-αvβ8和LAP-β1-Sepharose（1fM LAP-。以纯化胎盘AP（Applied Biosystems）为标准测定受体浓度。在平衡结合条件下（4°C下过夜）用10μl LAP-β1–Sepharose培养AP-β8的稀释液。使用CSPD底物（Tropix；Applied Biosystems）通过发光测定结合受体。（f） 表达β8的细胞与模拟转导的HT1080细胞与96 well板的LAP-β1（LAP）和SLC涂层孔的粘附。电池（5×104/孔），并在37°C下培养1小时后，通过离心法去除未结合细胞。吸光度(A类 595)用水晶紫染色后，如右图所示*第页< 0.05; **第页< 0.01.
图2。
图2。
αvβ8的细胞表面表达介导TGF-β的激活。HT1080（a）、MvLu（b）、SW480（c）和H647（d）细胞（β8转导或模拟转导）与TMLC报告细胞在存在或不存在中和抗β8抗体（37E1）或泛TGF-β中和抗体（1D11）的情况下共培养。相对荧光素酶单位表示减去TMLC背景的任意单位。星号表明，与经抗体处理或模拟对照相比，未经处理的β8表达细胞的荧光素酶活性增加。第页< 0.001.
图3。
图3。
细胞粘附LAP-β1或激活TGF-β不需要β8的细胞质域。（a） 构建β8亚基细胞质截断突变体。通过PCR诱变组装全长β8（FL）亚基、缺失COOH末端11个氨基酸（759）的部分截断突变体和缺失完整β8细胞质结构域（TM）的完全截断突变体，并将其亚克隆到逆转录病毒载体中。（b） 使用抗β8单克隆抗体（37E1）对表达FL、759、TM或逆转录病毒主干（模拟）的表面标记SW480细胞进行免疫沉淀分析。结果表明，在TM结构中，αv亚基存在于细胞表面并与之二聚，而细胞质结构域不存在。Western blotting检测生物素化蛋白。请注意，37E1对αvβ8具有特异性，因为在模拟转导细胞中未发现与αv亚单位或β8亚单位对应的两条免疫沉淀带。此外，值得注意的是，与759和FL相比，TM结构在细胞表面的表达水平较低。为了确定TM表达细胞中缺乏细胞内表位，用37E1免疫沉淀细胞裂解物，并使用针对整个β8细胞质结构域的多克隆抗β8抗体进行Western blotting分析。在b（底部）中，注意在截断突变体（TM）的β8免疫沉淀物中未发现β8的信号，表明缺乏β8细胞质结构域。（c） FACS公司®细胞质缺失突变体（TM和759）与SW480细胞中表达的野生型（FL）β8亚基的比较。注意，TM突变体的表达水平比759或FL构建体低六倍。显示了使用任意荧光单位的直方图。（d） 表达β8截短突变体的SW480细胞的粘附试验表明，β8的细胞质结构域不需要粘附到LAP-β1。请注意，尽管TM结构体的表面表达水平较低，但所有结构体都与LAP-β1结合良好，而模拟转导的SW480细胞不与LAP--β1结合。（e-f）证明激活TGF-β不需要β8细胞质结构域。表达野生型或截断突变体的SW480或HT1080细胞与TMLC报告细胞在存在或不存在抗β8（37E1）或泛抗TGF-β（1D11）的情况下共同培养。显示了相对荧光素酶单位。单星号和双星号表示未经处理的野生型或突变型β8表达细胞的荧光素酶活性高于经抗体处理或模拟对照细胞(*第页< 0.01; **第页< 0.001).
图4。
图4。
αvβ8激活TGF-β1依赖于金属蛋白酶活性（a）氢化金属蛋白酶抑制剂GM6001，而非非氢化控制肽C1006，抑制SW480细胞中αvβ8介导但非αvβ6介导的TGF-β活化。星号表示与其他三组相比，GM6001显著抑制了β8介导的激活(第页< 0.01). （b） 只有金属蛋白酶抑制剂抑制αvβ8介导的TGF-β活化。天冬氨酸（胃蛋白酶抑制素A）、丝氨酸（PMSF、CK-23、抑肽酶和亮氨酸蛋白酶）或半胱氨酸（亮氨酸蛋白酶和E64）蛋白酶抑制剂不能抑制SW480细胞中αvβ8介导的TGF-β活化。β8-和β6-介导的活化通过与a中的37E1或10D5中和或b中的37El中和来确定。星号表示GM6001与其他抑制剂相比具有显著抑制作用(第页< 0.01).
图5。
图5。
活性TGF-β被释放到αvβ8表达细胞的上清液中。（a） 使用β8（14E5）或β6（E7P6）整合素亚单位特异性单克隆抗体在β8-、β6-和模拟转染HT1080细胞的细胞表面表达β8和β6。（b） 与TMLC报告细胞共培养中β8-和β6-介导的TGF-β活化的比较。（c） 检测从β8-表达但非β6-或模拟转导的HT1080细胞上清液中释放的活性TGF-β。TGF-β的中和抗体为1D11，β8或β6的中和抗体分别为37E1或10D5。相对荧光素酶单位如b和c所示。星号表示与抗体处理或模拟对照相比，未经处理的β8表达细胞上清液中的荧光素酶活性增加(第页< 0.01).
图6。
图6。
MT1-MMP缺乏，可在人肺癌细胞株H1264中重建。（a） 用MT1-MMP特异性引物对肿瘤细胞系进行RT-PCR筛查，结果表明H1264细胞中不存在MT1-MMPs。显示了使用β-肌动蛋白引物并行执行的控制扩增。（b） Western blotting证实了转导H1264细胞中MT1-MMP和ΔMT1-MMPs的表达。MT1-MMP或模拟转导的H1264细胞的细胞裂解液（40μg蛋白质）或ΔMT1-MMP-转导的H264细胞的细胞上清液通过10%SDS-page进行解析，并使用抗-MT1-MMP单克隆抗体通过Western blotting检测蛋白质。MT1-MMP全长形式的预期迁移量为63 kD。请注意，分泌型（ΔMT1-MMP）迁移更快（54 kD），模拟感染细胞不表达MT1-MMP。（c） 将MT1-MMP、ΔMT1-MMP-或模拟转导的β8-过度表达的H1264细胞接种在含有重组pro–MMP-2的无血清培养基中的96个培养皿上。在37°C、5%CO中培养过夜后2对上清液进行明胶酶谱分析（1 mg明胶/ml，10%SDS-PAGE）。Pro-MMP2以66 kD迁移，而完全激活的形式以59 kD迁移。注意，只有MT1-MMP-转导的H1264细胞激活MMP-2。基质金属蛋白酶活性显示为在深色考马斯染色背景下的透明条带。
图7。
图7。
αvβ8介导用MT1-MMP活性重建的β8过度表达H1264细胞中TGF-β的激活。（a） β8转导的MT1-MMP、ΔMT1-MMP或模拟转导的H1264细胞的流式细胞术显示，使用抗β8抗体（14E5），β8的表面表达水平相当。显示了使用任意单位的直方图。（b） 用MT1-MMP、ΔMT1-MMP或单独逆转录病毒载体（模拟）转导的β8-过表达H1264细胞（1.6×104)与TMLC（1.6×10）共培养4)存在或不存在抑制剂的报告细胞：抗β8（37E1）、对照肽（C1006）、GM6001或泛TGF-β1抗体（1D11）。星号表明表达MT1-MMP的细胞与未经处理的细胞显著不同。（c） 内源性抑制剂TIMP-2而非TIMP-1抑制H1264s细胞中αvβ8介导的TGF-β活化。在TIMP-1（1μg/ml）、TIMP-2（1μg/ml）、GM6001（5μM）、抗β8（37E1）或pan-TGF-β1（1D11）存在或不存在的情况下，将β8-过表达、MT1-MMP-表达的H1264s细胞与TMLC共培养。b和c中显示了相对荧光素酶单位（在有或无抑制剂的情况下共培养细胞的光单位减去TMLC细胞单独的光单位）。由于TMLC细胞激活TGF-β的背景很小，偶尔观察到荧光素素酶值为负。单星号和双星号表示处理过的细胞与未处理的细胞相比(*第页< 0.01; **第页< 0.001).
图8。
图8。
αvβ8和MT1-MMP在基底接触中共定位。（a，top）MT1-MMP–GFP的免疫沉淀125I细胞表面标记的MT1-MMP–GFP–表达HT1080细胞。催化活性的90-kD MT1-MMP-GFP融合蛋白（星号）与来自表达MT1-MMP–GFP的HT1080β8细胞的抗GFP抗体免疫沉淀，但不包括模拟转导的HT1080-β8细胞。70-kD MT1-MMP–GFP带代表一种催化非活性降解产物。（a，底部）MT1-MMP–GFP–转导或模拟转导HT1080β8细胞上清液的明胶酶谱。显示了基质金属蛋白酶-2的Pro（Pro−）和活性（Act.−）形式的迁移。（b–m）免疫荧光显微镜的共焦图像。β8表达，MT1-MMP-GFP-表达HT1080细胞（b–d和k–m）；β8表达的HT1080细胞（e–g）；表达GFP的HT1080细胞（h–j）。细胞被允许在4小时内附着在LAP-β1（10μg/ml涂层浓度）涂层载玻片上。固定和渗透后，使用多克隆抗β8抗体和单克隆抗GFP抗体测定β8和GFP的共定位。显示了在基板平面上拍摄的β8（红色）和GFP（绿色）染色的伪彩色共焦图像。棒材，7.5μM。
图9。
图9。
细胞表面相关的MT1-MMP裂解并灭活LAP-β1（a） LAP-β1通过与β8-过度表达的MT1-MMP而非ΔMT1-MMP或模拟转导的H1264细胞孵育而被裂解。将LAP-β1（10μg/ml）与无细胞（第1层）、模拟转导的β8-过表达H1264细胞（第2层）、ΔMT1-MMP转导、β8-过度表达H1264cells（第3层）、MT1-MMP-转导、？8-过表示H1264的细胞（第4层）、500μg/ml对照肽（C1006；第5层）、，或500μg/ml羟化物抑制剂GM6001（通道6）。在还原条件下，用12.5%SDS-PAGE溶解20 ng输入LAP-β1。用抗LAP抗体进行免疫印迹后，显示了按照分子量标准（GIBCO BRL）校准的裂解产物的迁移。注意，只有在MT1-MMP存在下孵育的LAP-β1被裂解，并且这种裂解被GM6001阻断。（b） TGF-β1肽GRRGDLATIH选择性抑制αvβ8–LAP-β1的功能。β8-过表达、MT1-MMP表达H1264细胞（4×104)在存在或不存在50μg/ml GRRGDLATIH的情况下，LAP-β1、VN或纤维连接蛋白（FN）（10μg/ml涂层浓度）。（c） 通过MT1-MMP-转导的β8-过度表达的H1264细胞对LAP-β1的切割被GRRGDLATIH抑制，但不被GRRGELATIH肽（10μg/ml）抑制。采用免疫印迹法进行降解试验，并对其进行分析，如在a.No-cell对照组（1区）；无禁止控制（车道2）；对照GRRGELATIH肽（第3通道）；GRRGDLATIH肽（通道4）。（d） LAP-β1被β8-过表达、MT1-MMP-表达的H1264细胞灭活。将LAP-β1（5μg）与β8-过表达、MT1-MMP-表达或β8-过度表达、模拟转导的H1264细胞孵育过夜，并在重组TGF-β1存在的情况下添加到TMLC报告细胞中。作为对照（白条），TMLC报告细胞仅与重组TGF-β一起孵育，而不与LAP-β1一起孵育。显示了相对荧光素酶单位。星号表示与模拟对照细胞孵育的LAP-β1未被裂解，与其他组相比TGF-β活性降低(第页< 0.05).
图10。
图10。
TGF的激活-β通过αv（v）β8与肺癌肿瘤异种移植中的生长抑制和纤维生成有关。（a） 在表达αvβ8的H647细胞中，DNA合成受到抑制，这种抑制被TGF-β阻断抗体（1D11）逆转。星号表示与未经处理的β8表达细胞相比，经抗体处理的β8-表达细胞的BrdU掺入量增加(第页< 0.05). （b） 裸鼠体内肿瘤生长的组织学分析，来源于表达β8或模拟转导的H647细胞。图中显示了肿瘤细胞岛（t）之间致密胶原蛋白（箭头之间的绿色区域）的三色染色切片。棒材，75μm。（c） β8表达和模拟转导的肺肿瘤异种移植物中活性和SLC的测定。显示了相对荧光素酶单位。星号表示与模拟转导肿瘤相比，β8表达肿瘤中的TGF-β活性增加(*第页< 0.01).
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