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.2001年11月15日；20(22):6540-9.
doi:10.1093/emboj/20.22.6540。

胚胎干细胞靶向基因替换需要结构特异性内切酶Ercc1-Xpf

L J尼德恩霍夫 1, J Essers公司, G威达, B贝弗卢, 德威特法官, M Muijtjens先生, H Odijk先生, J H霍伊梅克斯, R卡纳尔
附属公司

胚胎干细胞靶向基因替换需要结构特异性内切酶Ercc1-Xpf

L J尼德恩霍夫等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

Ercc1-Xpf异二聚体是一种高度保守的结构特异性内切酶，在多种DNA修复途径中发挥作用，这些修复途径对维持基因组稳定性至关重要，包括核苷酸切除修复、链间交联修复和同源重组。Ercc1-Xpf在双链/单链连接处切割双链DNA，使其成为处理含有部分未缠绕链的DNA结构的理想酶。在这里，我们证明，虽然Ercc1对于姐妹染色单体之间的重组是必不可少的，但对于小鼠胚胎干细胞中的靶向基因替换是必不可少的。令人惊讶的是，Ercc1-Xpf在基因靶向中的作用与其之前确定的从重组中间产物中移除非同源末端的作用不同，因为无论DNA靶向结构的末端是异源的还是与基因组位点同源的，都需要Ercc1-Xpf。我们的观察结果对哺乳动物细胞中的基因靶向机制具有启示，并定义了Ercc1-Xpf在哺乳动物同源重组中的新作用。我们提出了靶向基因替换机制的模型，该模型调用Ercc1-Xpf在使受体基因组位点接受基因替换方面的作用。

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数字

无
图1。二者相继失活的靶向策略mErcc1（错误1）小鼠ES细胞中的等位基因。(A类)方案顶部描绘了mErcc1（错误1）带有相关限制位点的基因组位点。数字框表示外显子。下面描述了两个目标结构。第7外显子mErcc1是被插入neoR（右）或湿度计R（右）包含诊断信息的标记巴姆HI限制站点。ES细胞首先转染有mErcc1（错误1）新霉素磷酸转移酶基因构造。从抗性克隆中分离出基因组DNA，用巴姆HI，并使用5′外部探针（如上述结构所示）通过DNA杂交进行分析。预期基因组片段的长度用结构下方的水平箭头表示。mErcc1（错误1）+/–细胞随后被转染mErcc1（错误1）湿度计/em>构建并在潮霉素B选择下生长。阳性克隆通过DNA印迹分析。(B类)DNA印迹的一个例子巴姆显示了从ES克隆中分离出的HI消化基因组DNA，并用5′外探针进行了探测。探针检测到8-kb片段（wt等位基因）和4.8-kb片段R（右）突变体）或4.2-kb等位基因（neoR（右）突变体）。鉴定出两个独立的双突变体克隆。
无
图2。wt的免疫印迹分析，mErcc1（错误1）–/–和拯救突变ES细胞裂解物。(A类)使用α-hERCC1多克隆抗体对WCE进行免疫印迹。抗体识别阳性对照（HeLa细胞，第6通道）中的39 kDa带。通道2-4包含来自三个细胞系（#8、9和10）的裂解物，这些细胞系是通过稳定转染mErcc1（错误1）–/–构造包含hERCC1型cDNA与YFP框内耦合。仅全长融合蛋白的表达被视为预测分子量为66 kDa（39 kDa ERCC1+27 kDa YFP）的单一条带。5号通道含有来自mErcc1（错误1）–/–ES细胞。(B类)使用α-hXPF多克隆抗体对WCE进行免疫印迹。在HeLa细胞和wt ES细胞裂解物（分别为通道2和3）中可以看到对应于XPF（115 kDa）的带，但在mErcc1（错误1）–/–突变系（车道4）。使用hERCC1–YFP将Xpf波段恢复到生理水平（通道5）。ES细胞中交叉反应带的存在（~75kDa）起到负载控制的作用。
无
图3。UV、MMC和IR对wt和mErcc1（错误1）–/–ES细胞。(A类)wt的克隆存活率（平方），mErcc1（错误1）–/–（三角形）和紫外线照射后拯救的突变线（圆形）。与未经处理的细胞相比，经过辐照的细胞能够形成菌落的百分比与紫外线的剂量成正比。(B类)wt的克隆存活率，mErcc1型–/–以及用MMC处理1小时后挽救的突变株系(C类)IR处理后ES细胞的克隆形成存活率mErcc1（错误1）–/–该品系对辐照不敏感，未对挽救品系进行测试。安米半径54–/–ES线（钻石）作为辐照阳性对照。
无
图4。量化wt和mErcc1（错误1）–/–ES细胞。(A类)顶部，是米半径54显示了基因组位点。外显子被描述为带编号的盒子。目标构造是通过插入puro生成的R（右）表达盒插入内含子3。一旦同源重组到基因组中斯图包含该区域的I片段从9.0 kb缩短到8.5 kb。目标结构从载体中分离出来，作为生态RI片段（与米半径54位点，可选择标记除外），或克拉I–不是I片段（其在构建体的5′端包含32 bp的细菌序列，在3′端包含14 bp的细菌序列，用虚线表示；未按比例绘制）。用嘌呤霉素筛选出稳定的转化子。(B类)从单个抗性克隆中分离基因组DNA，并在斯图我消化。靶向性是通过使用来自第7外显子和第8外显子的3′外部探针出现8.5 kb的DNA片段来检测的米半径54cDNA。
无
图5。Ercc1–Xpf依赖性基因替换模型。线性靶向结构或供体DNA的两条链用蓝色阴影表示。供体DNA的中心部分（以红色显示）表示与受体DNA没有同源性的序列延伸。非同源结构域通常是一个可选择的标记基因。基因组或受体DNA的两条链以紫色阴影显示。带有梯度填充图案的箭头表示新的DNA合成。(A类)供体的外核溶解过程显示3′端。(B类)供体DNA的两个3′端侵入受体DNA的同源序列，形成两个D环。(C类)通过分支迁移（i）在近端扩展D环，也可能通过DNA复制在远端扩展D环（使用入侵的供体链作为引物，受体链作为模板）（ii）。(D类)分支迁移继续，直到供体DNA中的非同源区域阻止了进一步的异源双链形成。结构特异性Ercc1–Xpf核酸内切酶的底物用箭头表示。绿色斜箭头表示预测的主要Ercc1–Xpf解理位置。绿色虚线箭头表示另一个卵裂位点，也可能导致基因替换。绿色细箭头表示Ercc1–Xpf的第三个潜在底物，因为它不能导致基因替换，所以不能产生生产力。(E类)Ercc1–Xpf在特征ds/ss接合处切割停滞的中间产物，仅5′到3′ss域（D中粗体箭头处）。(F类)将受体DNA中的缺口转换为DSB。这种断裂是由异源双链DNA保持两个基因组末端接近而稳定的。(G公司)通过Ercc1–Xpf切口将非同源序列非保守插入受体DNA中新3′端聚合或不聚合的DSB中，即可实现基因替换。分离需要瓣内切酶和DNA连接酶的活性。
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