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.2001年7月16日；20(14):3800-10.
doi:10.1093/emboj/20.14.3800。

丝氨酸230的磷酸化促进热休克因子1的诱导转录活性

C I霍姆伯格 1, V希塔坎加斯, 米哈伊洛夫, J O Rantanen先生, M卡利奥, 一个Meinander, J赫尔曼, N莫里斯, C麦金托什, R I Morimoto先生, J E埃里克森, L西斯顿
附属公司

丝氨酸230的磷酸化促进热休克因子1的诱导转录活性

C I霍姆伯格等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

热休克因子1（HSF1）是应激反应的一种富含丝氨酸的结构性磷酸化介质。在压力下，HSF1形成DNA结合三聚体，重新定位为核颗粒，经历诱导性磷酸化，并获得反式激活物的特性。HSF1在多个位点被磷酸化，但这些位点及其功能仍然是一个谜。在这里，我们分析了人HSF1内源性磷酸化位点，并开发了一种磷酸肽抗体，以确定Ser230是一种新的体内磷酸化位点。Ser230位于HSF1的调节域，促进可诱导转录活性的大小。Ser230位于钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）的一致位点，CaMKIL过度表达可提高体内Ser230磷酸化水平和HSF1的反式激活水平。当在HSF1（-/-）细胞中表达时，与野生型HSF1相比，S230A HSF1突变体的活性显著降低，进一步证实了Ser230的重要性。我们的研究首次证明磷酸化对HSF1的转录活性至关重要，因此对热休克反应的诱导至关重要。

PubMed免责声明

数字

无
图1。异构体内HSF1磷酸化。K562细胞体内标记为[32P] 在他们遭受热休克（HS）或未经治疗（C）之前，将正磷酸盐注射3小时。HSF1用抗hHSF1抗体进行免疫沉淀，并在8%SDS–PAGE上解析。(A类)免疫沉淀HSF1的放射自显影。星号表示未知的磷蛋白。(B类)免疫沉淀HSF1的磷酸分析。指出了磷酸化丝氨酸、磷酸化苏氨酸和磷酸化酪氨酸的相对位置。(C)HSF1的色氨酸磷酸肽图谱。黑色箭头表示热休克时检测到的一种新的磷酸肽，白色箭头表示热应激时磷酸肽的强度显著增强。结果中解释了磷酸肽-1、-2和-z。
无
图2。HSF1 Ser230磷酸化的鉴定体内. (A类)人工Edman降解来源于体内 32P-标记的内源性HSF1（图1C）。循环32P释放，显示相应的磷酸肽序列和磷酸化残基。(B类)人体HSF1的示意图。显示Ser230在调节域中的位置。DBD，DNA-结合域；HR-A/B和-C，疏水性重复序列A/B和C；RD，监管领域；AD，激活域。
无
图3。CaMKII磷酸化Ser230上的rhHSF1。(A类)rhHSF1磷酸化的放射自显影在体外由CaMKII编制。(B类)免疫沉淀的色氨酸磷酸肽定位32来自热休克K562细胞（HS）或磷酸化rhHSF1的P标记HSF1在体外由CaMKII编制。箭头标记具有类似迁移模式的磷酸肽体内和在体外. (C)突变HSF1的色氨酸磷酸肽定位。用野生型或S230A HSF1-Myc-His转染K562细胞，体内标记为[32P] 正磷酸盐，并受到热休克。HSF1用抗Myc抗体免疫沉淀，然后进行胰蛋白酶磷酸肽定位。箭头代表S230A中不存在的磷酸肽。
无
图3。CaMKII磷酸化Ser230上的rhHSF1。(A类)磷酸化rhHSF1的放射自显影在体外由CaMKII编制。(B类)免疫沉淀的色氨酸磷酸肽定位32来自热休克K562细胞（HS）或磷酸化rhHSF1的P标记HSF1在体外由CaMKII编制。箭头标记具有类似迁移模式的磷酸肽体内和在体外. (C)突变HSF1的色氨酸磷酸肽定位。用野生型或S230A HSF1-Myc-His转染K562细胞，体内标记为[32P] 正磷酸盐，并受到热冲击。HSF1用抗Myc抗体免疫沉淀，然后进行胰蛋白酶磷酸肽定位。箭头表示S230A中不存在的磷酸肽。
无
图3。CaMKII磷酸化Ser230上的rhHSF1。(A类)rhHSF1磷酸化的放射自显影在体外由CaMKII编制。(B类)免疫沉淀的色氨酸磷酸肽定位32来自热休克K562细胞（HS）或磷酸化rhHSF1的P标记HSF1在体外由CaMKII编制。箭头标记具有类似迁移模式的磷酸肽体内和在体外. (C)突变HSF1的色氨酸磷酸肽定位。用野生型或S230A HSF1-Myc-His转染K562细胞，体内标记为[32P] 正磷酸盐，并受到热休克。HSF1用抗Myc抗体免疫沉淀，然后进行胰蛋白酶磷酸肽定位。箭头代表S230A中不存在的磷酸肽。
无
图4。特性体内用磷酸肽特异性抗体在hHSF1上磷酸化Ser230。(A类)未经处理（C）和热休克（HS）K562细胞以及磷酸化的rhHSF1（5 ng）和rhHSF1的全细胞提取物（60µg）在体外用CaMKII（pS230-rhHSF1，5 ng）在8%SDS-PAGE上进行解析，并用抗pS230-hHSF1抗体（-）进行免疫印迹。抗体与游离磷酸肽预先孵育，以竞争性抑制免疫反应（+）。(B类)HeLa细胞暴露于热休克（HS）和CdSO4（100µM）或未经处理（C）。使用磷酸化Ser230（pS230-HSF1）、HSF1、Hsp70和Hsc70的抗体，通过western blotting分析全细胞提取物（左侧面板）。通过凝胶迁移率变化试验（右图）检测全细胞提取物中的HSF1 DNA结合活性。HSF、HSF1–HSE综合体；NS，非特异性DNA结合活性。(C)在凝胶迁移率变化分析之前，将暴露于热休克（HS）的HeLa细胞的全细胞提取物与抗pS230-hHSF1（α-pS230）、抗hHSF1、抗HSF2（α-HSF2）抗体或免疫前血清（PS）孵育。(D类)对HeLa细胞进行热休克（HS）或保持在37°C（对照），并使用抗pS230-hHSF1（pS230，绿色）和抗hHSF1抗体（HSF1，红色）进行免疫荧光分析。DNA用DAPI染色。箭头表示HSF1核颗粒。
无
图4。特性体内用磷酸肽特异性抗体在hHSF1上磷酸化Ser230。(A类)未处理（C）和热休克（HS）K562细胞的全细胞提取物（60µg），以及磷酸化的rhHSF1（5 ng）和rhHSF1在体外用CaMKII（pS230-rhHSF1，5 ng）在8%SDS-PAGE上进行解析，并用抗pS230-hHSF1抗体（-）进行免疫印迹。抗体与游离磷酸肽预先孵育，以竞争性抑制免疫反应（+）。(B类)HeLa细胞暴露于热休克（HS）和硫化镉4（100µM）或未经处理（C）。使用磷酸化Ser230（pS230-HSF1）、HSF1、Hsp70和Hsc70的抗体，通过western blotting分析全细胞提取物（左侧面板）。通过凝胶迁移率变化试验（右图）检测全细胞提取物中的HSF1 DNA结合活性。HSF、HSF1–HSE综合体；NS，非特异性DNA结合活性。(C)在凝胶迁移率变化分析之前，将暴露于热休克（HS）的HeLa细胞的全细胞提取物与抗pS230-hHSF1（α-pS230）、抗hHSF1、抗HSF2（α-HSF2）抗体或免疫前血清（PS）孵育。(D类)对HeLa细胞进行热休克（HS）或保持在37°C（对照），并使用抗pS230-hHSF1（pS230，绿色）和抗hHSF1抗体（HSF1，红色）进行免疫荧光分析。DNA用DAPI染色。箭头表示HSF1核颗粒。
无
图4。特性体内用磷酸肽特异性抗体在hHSF1上磷酸化Ser230。(A类)未经处理（C）和热休克（HS）K562细胞以及磷酸化的rhHSF1（5 ng）和rhHSF1的全细胞提取物（60µg）在体外用CaMKII（pS230-rhHSF1，5 ng）在8%SDS-PAGE上进行解析，并用抗pS230-hHSF1抗体（-）进行免疫印迹。抗体与游离磷酸肽预先孵育，以竞争性抑制免疫反应（+）。(B类)HeLa细胞暴露于热休克（HS）和硫化镉4（100µM）或未经处理（C）。使用磷酸化Ser230（pS230-HSF1）、HSF1、Hsp70和Hsc70的抗体，通过western blotting分析全细胞提取物（左侧面板）。通过凝胶迁移率变化试验（右图）检测全细胞提取物中的HSF1 DNA结合活性。HSF、HSF1–HSE综合体；NS，非特异性DNA结合活性。(C)在凝胶迁移率变化测定之前，将暴露于热休克（HS）的HeLa细胞的全细胞提取物与抗pS230-hHSF1（α-pS230）、抗hHSF1（α-hHSF1）、抗HSF2（α-HSF2）抗体或免疫前血清（PS）孵育。(D类)对HeLa细胞进行热休克（HS）或保持在37°C（对照），并使用抗pS230-hHSF1（pS230，绿色）和抗hHSF1抗体（HSF1，红色）进行免疫荧光分析。DNA用DAPI染色。箭头表示HSF1核颗粒。
无
图4。特性体内用磷酸肽特异性抗体在hHSF1上磷酸化Ser230。(A类)未经处理（C）和热休克（HS）K562细胞以及磷酸化的rhHSF1（5 ng）和rhHSF1的全细胞提取物（60µg）在体外用CaMKII（pS230-rhHSF1，5 ng）在8%SDS-PAGE上进行解析，并用抗pS230-hHSF1抗体（-）进行免疫印迹。抗体与游离磷酸肽预先孵育，以竞争性抑制免疫反应（+）。(B类)HeLa细胞暴露于热休克（HS）和硫化镉4（100µM）或未经处理（C）。使用磷酸化Ser230（pS230-HSF1）、HSF1、Hsp70和Hsc70的抗体，通过western blotting分析全细胞提取物（左侧面板）。全细胞提取物中的HSF1 DNA结合活性通过凝胶迁移率变化测定法进行检测（右图）。HSF、HSF1–HSE综合体；NS，非特异性DNA结合活性。(C)在凝胶迁移率变化分析之前，将暴露于热休克（HS）的HeLa细胞的全细胞提取物与抗pS230-hHSF1（α-pS230）、抗hHSF1、抗HSF2（α-HSF2）抗体或免疫前血清（PS）孵育。(D类)对HeLa细胞进行热休克（HS）或保持在37°C（对照），并使用抗pS230-hHSF1（pS230，绿色）和抗hHSF1抗体（HSF1，红色）进行免疫荧光分析。DNA用DAPI染色。箭头表示HSF1核颗粒。
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图5。CaMKII增加HSF1上Ser230的热诱导反式激活和磷酸化。K562细胞与一个编码组成活性CaMKII的质粒和一个LSN报告子构建物共同转染。将转染体暴露于热休克后在37°C（R）下恢复6小时或不处理（C）。模拟细胞与空载体和报告质粒共同转染。(A类)CAT分析被量化，未经处理的模拟转染体中的CAT活性被指定为1倍诱导。数据代表两次独立实验的平均值±SEM。(B类)从上述细胞中制备全细胞提取物，并使用抗pS230-hHSF1抗体（上面板）和抗hHSF1（下面板）进行免疫印迹分析。星号表示未知的蛋白质带。(C)用凝胶迁移率变化法检测热休克（HS）转染体中HSF1 DNA结合活性。(D类)用LSN质粒转染HeLa细胞，并将其暴露于热休克中，然后在37°C条件下，在没有（R）或存在KN-62（KN+R，在热休克前15分钟添加10µM KN-62）或仅KN-62的情况下恢复6小时。数据表示重复进行的三个独立实验的平均值±SEM*第页与热休克细胞（R）相比，<0.05。
无
图5。CaMKII增加热诱导的HSF1上Ser230的反式激活和磷酸化。K562细胞与一个编码组成活性CaMKII的质粒和一个LSN报告子构建物共同转染。将转染体暴露于热休克后在37°C（R）下恢复6小时或不处理（C）。模拟细胞与空载体和报告质粒共同转染。(A类)对CAT测定进行定量，并将未处理的模拟转染子中的CAT活性分配为1的倍数诱导。数据代表两次独立实验的平均值±SEM。(B类)从上述细胞中制备全细胞提取物，并使用抗pS230-hHSF1抗体（上面板）和抗hHSF1（下面板）进行免疫印迹分析。星号表示未知的蛋白质带。(C)用凝胶迁移率变化法检测热休克（HS）转染体中HSF1 DNA结合活性。(D类)用LSN质粒转染HeLa细胞，并将其暴露于热休克中，然后在37°C条件下，在没有（R）或存在KN-62（KN+R，在热休克前15分钟添加10µM KN-62）或仅KN-62的情况下恢复6小时。数据表示重复进行的三个独立实验的平均值±SEM*第页与热休克细胞（R）相比，<0.05。
无
图6。S230A降低了转录活性。(A类)将野生型或突变型GAL4-HSF1、G5BCAT报告质粒和内部对照RSVβ-gal。转染体暴露于热休克后3 h恢复（+）。未经处理的转染剂用（-）表示。未经处理的野生型GAL4-HSF1转染体中CAT活性的诱导倍数为1。数据代表两次独立实验的平均值±SEM。（B–D）hsf1–/–用野生型（hHSF1）或S230A（S230A）hHSF1-Myc-His质粒转染MEF（–/–），含有内源性HSF1的MEF。细胞暴露于热休克（HS）、热休克后3小时恢复（R）或未经处理（C）。(B类)使用HSF1、Hsp70和Hsc70抗体进行蛋白质印迹分析。请注意，与–/–细胞的HSF1印迹相比，+/+的HSF1 blot暴露的时间更长。为了量化，野生型hHSF1转染者中的Hsp70水平被指定为100%。数据表示来自三个独立实验的平均值±SEM。(C)使用抗pS230-hHSF1抗体（上部面板）和抗hHSF1（下部面板）进行蛋白质印迹。(D类)通过凝胶迁移率变化分析HSF1 DNA结合活性。
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图6。S230A降低了转录活性。(A类)将野生型或突变型GAL4-HSF1、G5BCAT报告质粒和内部对照RSVβ-gal。转染体暴露于热休克后3 h恢复（+）。未经处理的转染剂用（-）表示。未经处理的野生型GAL4-HSF1转染子中的CAT活性被赋予1倍的诱导。数据代表两次独立实验的平均值±SEM。（B–D）hsf1–/–用野生型（hHSF1）或S230A（S230A）hHSF1-Myc-His质粒转染MEF（–/–），含有内源性HSF1。细胞暴露于热休克（HS）、热休克后3小时恢复（R）或未经处理（C）。(B类)使用HSF1、Hsp70和Hsc70抗体进行蛋白质印迹分析。请注意，与–/–细胞的HSF1印迹相比，+/+的HSF1 blot暴露的时间更长。为了量化，野生型hHSF1转染者中的Hsp70水平被指定为100%。数据表示来自三个独立实验的平均值±SEM。(C)使用抗pS230-hHSF1抗体（上部面板）和抗hHSF1（下部面板）进行蛋白质印迹。(D类)通过凝胶迁移率变化分析HSF1 DNA结合活性。
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图7。磷酸化介导的hHSF1转录活性大小调节模型。根据迄今为止确定的磷酸化位点，HSF1包含一个激活位点S230（绿色）和三个抑制位点S303、S307和S363（红色）。在这些位点中，丝氨酸230、303和307定位于因子的调控域。应激时，Ser230磷酸化增强，激活和抑制位点之间的摩尔比决定转录活性的大小。箭头的粗细表示转录活动的程度。反式激活效力由磷酸化HSF1的异质群体赋予。在缺乏Ser230磷酸化的情况下，在压力下获得适度的转录活性，这可能是由迄今为止尚未表征的诱导和组成磷酸化位点介导的。HSF1的DNA结合活性不需要Ser230磷酸化。
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