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.2001年7月；21(13):4129-39.
doi:10.1128/MCB.211.4129-4139.2001。

ATR介导的检查点通路调节人Chk1的磷酸化和活化

H Zhao先生 1, H Piwnica蠕虫
附属公司

ATR介导的检查点通路调节人Chk1的磷酸化和活化

H Zhao先生等。 分子细胞生物学. 2001年7月.

摘要

Chk1是一种进化上保守的蛋白激酶，调节细胞周期进程以响应检查点激活。在这项研究中，我们证明了阻断DNA复制或导致某些形式的DNA损伤的试剂会诱导人类Chk1的磷酸化。磷酸化形式的Chk1具有较高的内在蛋白激酶活性，在凝胶过滤柱上洗脱更快。丝氨酸317和345被鉴定为体内磷酸化位点，而ATR（ATM和Rad3相关蛋白激酶）在体外磷酸化了这两个位点。此外，体内丝氨酸317和345上Chk1的磷酸化依赖于ATR。含有丙氨酸而非丝氨酸317和345的Chk1突变体在体内对复制阻滞或基因毒性应激的反应较差，体外ATR磷酸化较差，凝胶过滤在快速洗脱组分中未发现。这些发现表明，Chk1对复制阻滞和某些形式的遗传毒性应激的反应涉及丝氨酸317和345的磷酸化。此外，这项研究表明ATR是人类细胞中Chk1的直接上游激活物。

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数字

图1
图1
检查点诱导的Chk1磷酸化和活化。（A） HeLa和U20S细胞未经处理（−）或用3 mM HU处理（+）20 h。含有150μg蛋白质的细胞裂解物通过SDS-PAGE（1、2、5和6道）直接溶解，或在没有（3道）或存在（+INH）磷酸酶抑制剂的情况下，用5 U小牛肠磷酸酶（CIP）处理，包括10 mMβ-甘油磷酸和10 mM NaF（第4车道）。用Chk1特异性多克隆抗体（SC7898）进行Western blotting检测Chk1。（B） HeLa细胞在DMEM中单独培养（1区）或含有50μM顺铂（2区）、3μM足叶乙甙（3区）或3μM ara-C（4区）的DMEM培养1h，然后用新鲜DMEM替换培养基，然后细胞再培养6h2（第5车道）。含有150μg蛋白质的细胞裂解物在8%聚丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE直接溶解。用Chk1特异性多克隆抗体（SC7898）进行Western blotting检测Chk1。（C） HeLa细胞未经处理（−）或用3 mM HU处理（+）17 h。将澄清的细胞裂解物与亲和纯化的Chk1抗体孵育，并在5μg GST-Cdc25C存在下在体外进行激酶分析200–256通过SDS-PAGE解析反应，并将蛋白质转移到硝化纤维素上。放射性标记GST-Cdc25C200–256放射自显影。用Chk1特异性单克隆抗体（SC8408）通过蛋白质印迹法测定每种免疫沉淀物中Chk1的水平。
图2
图2
通过凝胶过滤分析Chk11。HeLa细胞要么被模拟感染，要么被编码标记Chk1的重组腺病毒感染。感染15小时后，细胞未经处理（−HU）或与10 mM HU（+HU）孵育4小时。澄清的裂解产物直接通过SDS-PAGE和Western blotting（总裂解产物）进行分析，或加载到Superdex 200 10/30柱上。对于模拟感染的细胞，通过SDS-PAGE分离来自组分23至30的150μl。对于腺病毒感染的细胞，首先用抗病毒琼脂糖培养组分23至30。用Chk1多克隆抗体（SC7898）进行Western blotting检测Chk1和Flag-Chk1。显示了含有158和44 kDa蛋白质标准物的组分。44-kDa蛋白质标准物主要在组分30和31中洗脱。
图3
图3
检查点诱导的Chk1磷酸化与ATM无关，但对咖啡因敏感。（A） 自动变速箱+和AT−细胞未经处理（通道1和4）或用3 mM HU处理（通道2和5）或用10 Gy IR照射（通道3和6）。含有150μg蛋白质的细胞裂解物在8%聚丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE直接溶解。用Chk1特异性多克隆抗体（SC7898）进行Western blotting检测Chk1。（B） HeLa细胞在缺乏咖啡因的DMEM中培养2.5小时（通道1和2）或含有10 mM咖啡因（通道3和4）。细胞在没有（通道1、3）或存在（通道2和4）3 mM HU的情况下再培养20小时。含有150μg蛋白质的细胞裂解物在8%聚丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE直接溶解。用Chk1特异性多克隆抗体（SC7898）通过蛋白质印迹检测Chk1。
图4
图4
Chk1在体内被丝氨酸317磷酸化。（A） ●●●●。对Chk1的结构进行了图示，以显示激酶结构域（氨基酸9至265）、C末端富含SQ的区域以及相对于潜在磷酸化位点的胰蛋白酶和天冬氨酸-N裂解位点的位置。（B至D）293细胞被模拟转染或转染表达myc-Chk1（野生型）或myc-Chk 1（S317A）的质粒。细胞与32在HU存在下P标记无机磷酸盐。用胰蛋白酶消化放射性标记的Chk1，并对肽进行二维磷酸肽定位。箭头指示第一个和第二个尺寸的方向，原点位于两个箭头相交的位置。（E） HeLa细胞未经处理（1和5道），或用3 mM HU（2、3、6和7道）或20 J UV m处理2（车道4和8）。按照SDS-PAGE的指示制备并分析裂解液（1到4道），或者首先在没有竞争性磷酸肽免疫原（5、6和8道）或存在竞争性磷酸肽类免疫原（7道）的情况下与S317磷酸特异性抗体孵育。用Chk1特异性单克隆抗体（SC8408）通过免疫印迹法检测Chk1。
图5
图5
Chk1在体内也被丝氨酸345磷酸化。用表达myc-Chk1（野生型）、myc-Chk1（S317A）、myc-Chk1和myc-Chk 1（S357A、S366A）的质粒转染293细胞。细胞与32在HU存在下P标记无机磷酸盐。用胰蛋白酶消化放射性标记的Chk1（野生型和突变型），然后用天冬氨酸-N内肽酶消化肽，并对肽进行二维磷酸肽定位。箭头指示第一和第二维度的方向，原点位于两个箭头相交的位置。
图6
图6
HU诱导的Chk1活化需要丝氨酸317和345的磷酸化。（A） HeLa细胞感染重组腺病毒，编码Flag-Chk1（野生型）、Flag-Cchk1（S317A）、Flage-Chkl（S345A）或Flag-Ck1。感染15小时后，将细胞与10 mM HU孵育4小时。将澄清的裂解产物加载到Superdex 200 10/30柱上。将分数26和27合并。将第26/27、28、29和30组分与反标记琼脂糖孵育。对沉淀物磷酸化GST-Cdc25C的能力进行监测200–25通过SDS-PAGE解析激酶反应，并将蛋白质转移到硝化纤维素。放射性标记GST-Cdc25C200–256通过放射自显影观察到Chk1，使用Chk1特异性多克隆抗体（SC7898）进行Western blotting观察到Chk 1。
图7
图7
磷酸化位点突变体保留固有的蛋白激酶活性。（A） 在细菌中纯化Chk1、Chk1（D130A）、Chkl（S317A）、Chk1（S345A）和Chk1的GST融合蛋白，并测试其磷酸化GST-Cdc25C的能力200–256体外试验。反应产物通过SDS-PAGE进行解析，并将蛋白质转移到硝化纤维素中。磷酸化Cdc25C200–256通过放射自显影检测，并用Chk1特异性多克隆抗体（SC7898）进行Western blotting观察GST-Chk1（野生型和突变型）的水平。（B） HeLa细胞被编码GFP（第1道）、Flag-Chk1（第2道）、Flag-Chk 1（S317A、S345A）（第3道）和Flag-Ch 1（D130A）的重组腺病毒感染。制备裂解物并与Flag琼脂糖一起孵育。测试沉淀磷酸化GST-Cdc25C的能力200–256体外试验。反应产物通过SDS-PAGE进行解析，并将蛋白质转移到硝化纤维素中。磷酸化Cdc25C200–256通过放射自显影检测，并用Chk1特异性多克隆抗体（SC7898）进行Western blotting观察GST-Chk1（野生型和突变型）的水平。
图8
图8
ATR和Chk1在体内外的相互作用。（A） 用编码激酶活性（ATR）的质粒转染293个细胞+)和-不活动（ATR−)标记ATR的形式。制备裂解液，并与反旗帜琼脂糖孵育。监测沉淀对融合到GST（GST-Chk1D130A）的细菌产生的激酶敏感型Chk1磷酸化能力。通过SDS-PAGE解析激酶反应，将蛋白质转移到硝化纤维素中，并通过放射自显影术显示放射性标记的Chk1。用编码标记ATR的质粒转染（B至E）293细胞。制备裂解液，并与反旗帜琼脂糖孵育。在细菌产生的GST-Chk1（D130A）、GST-Chk1（D130A，S317A）和GST-Chk 1（D130 A，S345A）存在的情况下进行激酶反应。用胰蛋白酶和天冬氨酸-N内肽酶消化放射性标记的Chk1蛋白，并对肽进行二维磷酸肽定位。显示了第一和第二个分离维度，原点位于两个箭头相交的位置。蛋白质水解的GST-Chk1（D130A）中的磷酸肽在映射（B）之前与未标记的磷酸肽（LVQGISFpSQPTCP）混合，或者磷酸肽单独分解（C）并用茚三酮染色。箭头指示未标记磷酸肽的位置。（F） 用编码激酶活性（ATR）的质粒转染293个细胞+)和-不活动（ATR−)标记ATR的形式。转染细胞未经处理（1、3、5和7道）或接受20 J紫外线照射2（车道2、4、6和8）。裂解液由SDS-PAGE（1到4道）指导制备和分析，或在SDS-PAGE（5到8道）之前首先与S317磷酸特异性抗体孵育。用Chk1特异性单克隆抗体（SC8408）免疫印迹法检测Chk1。
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