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.2000年11月1日；19(21):5845-55.
doi:10.1093/emboj/19.21.5845。

锌指蛋白Gfi-1通过与STAT3抑制剂PIAS3相互作用增强STAT3信号

Bödel公司 1, K塔瓦索利, H卡松基, T施密特, M巴赫曼, F沙珀, P海因里希, K帅, H P Elsässer公司, T莫雷
附属机构

锌指蛋白Gfi-1通过与STAT3抑制剂PIAS3相互作用增强STAT3信号

Bödel公司等人。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

STAT因子作为细胞因子受体的信号转导子，转录激活特定的靶基因。最近发现的蛋白PIAS3直接与STAT3结合并阻断转录激活。在这里，我们提供了实验证据，证明锌指蛋白Gfi-1是STAT3介导的信号转导中的一个新调节因子。这两种蛋白质之间的相互作用首先在酵母双杂交筛选中显现出来，但在真核细胞的共沉淀实验中也能看到。此外，我们发现Gfi-1和PIAS3在一个特征性的核点结构中共同定位。虽然PIAS3对靶启动子的STAT3介导的转录具有深刻的抑制作用，但Gfi-1可以克服PIAS3阻滞，并显著增强STAT3中介的转录激活。在原代T细胞中，Gfi-1能够扩增IL-6依赖性T细胞激活。由于Gfi-1是一种已知的主要原癌基因，我们的发现对最近描述的STAT3恶性转化细胞的能力具有特别重要的意义，并为Gfi-1在T淋巴细胞中的致癌潜力提供了解释。

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数字

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图1。酵母双杂交筛选确定PIAS3为Gfi-1的伴侣蛋白。(A类)LexA–Gfi-1融合蛋白的示意图，用作酵母双杂交筛选和三个LexA-Gfi-1突变体中的诱饵。只有全长Gfi-1和跨越氨基酸1–257的N末端部分能够与克隆12和45表达的蛋白质片段相互作用，但包含氨基酸1–20的SNAG结构域或延伸至氨基酸257至423的锌指结构域不能相互作用。NLS，核定位信号。(B类)通过β-半乳糖苷酶分析对使用所示LexA–Gfi-1融合构建物转化的酵母克隆#12和#45（菌株L40）中的Gfi-1–PIAS3相互作用进行量化。(C类)克隆#12和克隆#45的文库质粒中包含的序列相同，编码氨基酸391至583的PIAS3蛋白的C末端部分。
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图2。Gfi-1中需要一个大的N-末端区域来与PIAS3相互作用。(A类)利用全长LexA–Gfi-1诱饵构建物（Gfi-1 I）或指示突变体以及编码全长PIAS3蛋白的半乳糖诱导构建物与反式激活域VP16融合，对L40菌株进行酵母双杂交检测。相互作用取决于半乳糖（SG棒）的存在，并且只能用携带从氨基酸20到257的Gfi-1区域的诱饵检测到。(B类)诱饵载体中表达的Gfi-1突变体与LexA DNA结合域融合的示意图。指出了能够与全长PIAS3蛋白相互作用的突变体。(C类)LexA–Gfi-1融合蛋白和Gfi-1突变毒饵Gfi-1 II和IV–X的表达控制。表达控制（通道C）是LexA与CD95细胞质域的融合。酵母提取物在SDS–PAGE上分离，并通过电印迹转移到固体支持物上。用抗LexA抗体检测LexA–Gfi-1蛋白和对照蛋白。
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图3。PIAS3和Gfi-1相互作用体外试验。(A类)产生PIAS3蛋白并用[35S] 蛋氨酸在体外转录-翻译（单右车道）。Gfi-1突变体Gfi-1 II由N-末端区域、氨基酸1-257组成，但缺少锌指区域，是在细菌中产生的组氨酸标记蛋白（His–Gfi-1Ⅱ）。作为对照，使用了POU因子Brn-3a的N末端区域的组氨酸标记形式。这个35S标记的PIAS3蛋白可以通过NTA珠从与His–Gfi-1 II的混合物中沉淀，但不能从与无关蛋白His–Brn-3a的混合物中析出（放射自显影，上面板）。His–Gfi-1 II和His–Brn-3a均以相同水平产生（考马斯染色，下面板）。(B类)Gfi-1、PIAS3和Brn-3a的SDS-PAGE分析在体外直接来自转录-翻译反应的翻译产物（输入，1–3通道，右侧面板），以及在培养指示的在体外翻译蛋白与GST–Gfi-1或GST–PIAS3偶联的Sepharose珠（1-4通道，左侧面板）。孵育后的SDS-PAGE分析在体外单独与GST偶联的Sepharose珠翻译的蛋白质（泳道1-4，中间面板）。
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图4。内源性PIAS3和Gfi-1蛋白可以从人类细胞中共沉淀。(A类和B类)从人KIT 225 T细胞制备细胞核和细胞质提取物（见标记为N和C的通道），并用抗PIAS3c（Chung等或抗PIAS1/3（α-Pias3N）抗体（圣克鲁斯）。为了检测Gfi-1（箭头），通过SDS-PAGE和western blotting（We）分析沉淀物，使用抗Gfi-1 N20抗体（Santa Cruz）或亲和纯化抗Gfi1兔抗体（Schmidt等., 1998). (C类)采用抗PIAS3c抗体的免疫印迹法测定内源性PIAS3在人KIT 225 T细胞、HepG2细胞和HeLa细胞的细胞核和细胞质提取物（N和C道）中的表达水平。(D类)用（C）核提取物和抗PIAS3c抗体进行免疫沉淀。通过SDS-PAGE和western blotting（We）分析提取物和沉淀物，使用抗Gfi-1 N20抗体。Gfi-1只能从KIT 225提取物（箭头）中沉淀，而不能从HepG2或HeLa细胞提取物中沉淀。所有显示的数据都是几个独立实验的代表。
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图5。Gfi-1和PIAS3在核点中被检测到。(A类)转染GFP构建物的NIH 3T3细胞24小时后固定在乙醇中，并用碘化丙啶染色。为了检测Flag表位标记的PIAS3，用抗Flag抗体和TRITC标记的二级抗体转染活细胞后进行处理。然后用激光扫描共焦显微镜分析所有制剂。GFP–Gfi-1融合蛋白（左上角）、GFP–PIAS3（右上角和左中角）以及Flag表位标记的PIAS3在细胞核中以点状结构定位。在细胞质中发现了缺乏NLS的GFP–Gfi-1 II融合蛋白（左下）。GFP和Gfi-1突变体Gfi-1 III（GFP–Gfi-1Ⅲ）之间的融合蛋白仅由锌指结构域组成，仍位于细胞核中的点结构中（右下角）。(B类)将NIH 3T3细胞与直接表达标志性PIAS3和GFP–Gfi-1、GFP–G fi-1 II（仅限N末端）或GFP–g fi-1 III（仅限锌指）融合蛋白的构建物共转染。共聚焦显微镜显示，GFP–Gfi-1（顶行，左）和Flag–PIAS3（顶行、中）定位于核点中，当图片合并时，核点完全重叠（顶排，右）。GFP–Gfi-1 II留在细胞核外，并阻止Flag–PIAS3进入细胞核（中排）。当两张图片合并时，GFP–Gfi-1 II和Flag–PIAS3在细胞核外完美地共定位（中行，右）。GFP–Gfi-1 III（左下方行）和Flag–PIAS3（中下方行）在适当的结构体被共同转染时进入细胞核，但不协同定位（请注意右下方行中的红色和绿色圆点），因为GFP–G fi-1 III中缺少N末端相互作用域。
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图6。内源性PIAS3和转染的Gfi-1在核点中共定位。(A类)用GFP–Gfi-1构建物转染NIH 3T3细胞，用抗PIAS3c抗体和TRITC标记的二级抗体进行免疫染色，并用共焦显微镜进行分析。图中显示了三组独立的细胞，其中内源性PIAS3位于细胞核点和细胞质中（红色面板）。GFP–Gfi-1形成核点（绿色面板），并在核点内与PIAS3部分共定位（见合并图片，右图）。(B类)如（A）所示，但不是GFP–Gfi-1，而是转染了一个LTR–Gfi-1构建体，该构建体指导未标记Gfi-1蛋白的表达。通过使用抗Gfi-1抗体和特定FITC-标记的二级抗体（绿色面板）进行免疫染色来检测Gfi-1。如（A）所示，内源性PIAS3（红色面板）和转染的Gfi-1在核点（合并图片，黄色区域）中共定位，但可以看到两种蛋白质分离的区域（合并图片、绿色和红色区域）。(C类)用抗Gfi-1和抗PIAS3抗体以及用FITC标记的特异性二级抗体对KIT 225细胞进行免疫染色以检测Gfi-1（绿色，左图）或用TRITC标记的特异性二级抗体以检测PIAS3（红色，中图）。这两张图片的合并（右侧面板）显示了内源性Gfi-1和PIAS3在KIT 225细胞中的共定位（合并图片，黄色区域），但也显示了这两种蛋白质不形成复合物的区域。
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图7。Gfi-1减轻PIAS3区STAT3介导的转录激活。(A类)用pACT报告子、STAT3构建体和指定数量的CMV–PIAS3转染HepG2细胞。α的结构1-右表给出了具有两个STAT3结合位点的抗糜蛋白酶启动子。在STAT3和IL-6存在的情况下，与未使用IL-6（开放条）获得的值相比，pACT报告子可被激活约15倍（黑条），并且这种刺激可通过CMV–PIAS3以浓度依赖的方式共同转染而被抑制。(B类)左图：HepG2细胞与pACT、STAT3构建物和Gfi-1表达构建物（LTR–Gfi-1，数量如图所示）共转染。在IL-6（黑条）的存在下，Gfi-1可以以浓度依赖的方式进一步刺激pACT转录高达6倍。右图：核（N）和细胞质（C）提取物是从经LTR–Gfi-1转染或经IL-6处理的HepG2细胞中制备的。用SDS-PAGE和抗PIAS3抗体或酪氨酸705磷酸化时特异识别STAT3的抗体进行免疫印迹分析提取物。(C类)左面板：用pACT、STAT3和PIAS3表达载体转染HepG2细胞，并用IL-6处理。pACT报告基因转录的显著抑制如（B）所示。通过以浓度依赖的方式共表达Gfi-1表达构建体（LTR–Gfi-1），这种抑制几乎可以完全缓解。右图：在IL-6的存在下，通过表达Gfi-1突变体Gfi-1 II的构建物，pACT转录也可以得到类似的缓解，该突变体缺乏锌指区，但仍与PIAS3相互作用。
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图8。Gfi-1调节pACT和p600c-福斯发起人。(A类)与全长Gfi-1相比，突变型Gfi-1 III（仅包含锌指区）在IL-6存在下无法有效刺激pACT转录，无论是通过转染达到高外源性PIAS3水平还是仅存在内源性PIAS3。实验条件如图7所示。数字表示质粒转染量（微克）。(B类)内源性PIAS3和转染标记的PIAS3的表达水平不会因Gfi-1、Gfi-1 II或Gfi-1 III的共同表达而改变。用抗PIAS3c抗体免疫印迹法检测经上述处理的HepG2细胞全细胞提取物中的PIAS3蛋白。(C类)Gfi-1可以增强IL-6/STAT3介导的c-福斯发起人。报告基因构建体的转录，其中一个600 bp的c片段-福斯启动子驱动荧光素酶基因可以在HepG2细胞中用IL-6刺激，是不使用IL-6的2.5倍。共同转染指导Gfi-1或Gfi-1 II表达的构建物可进一步刺激c-Fos报告活性。SRE，血清反应元件；SIE，STAT-inducible元件。
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图9。Gfi-1可增强抗原刺激后IL-6依赖性T细胞的增殖。(A类)随着时间的推移，通过northern blotting检测刺激后分离的小鼠原代T细胞提取物中内源性PIAS3和Gfi-1基因的RNA表达水平。(B类)用于产生CD2–Gfi-1转基因小鼠的构建体的示意图。(C类)通过western blotting分析CD2–Gfi-1转基因系tg1和tg2动物胸腺细胞和淋巴结T细胞提取物中的Gfi-1蛋白水平。非转基因年龄匹配同卵双胞胎（ntg）的提取物作为对照。(D类)从非转基因对照小鼠（黑条）或CD2–Gfi-1转基因小鼠（开放条）中制备外周T细胞，并在指定条件下培养。细胞培养72小时并用[三H] 胸腺嘧啶核苷的摄取[三H] 胸腺嘧啶进行了测量，并在年-轴。所有测量均一式三份。给出了几个独立实验的平均值和标准偏差。
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