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.2000年7月；20(14):5300-9.
doi:10.1128/MCB.20.14.5300-5309.2000。

单链退火途径的DNA长度依赖性和酿酒酵母RAD59在双链断裂修复中的作用

N Sugawara公司 1, G Ira公司, J E哈伯
附属公司

单链退火途径的DNA长度依赖性和酿酒酵母RAD59在双链断裂修复中的作用

N Sugawara村等。 分子细胞生物学. 2000年7月.

摘要

酿酒酵母中HO内切酶产生的DNA双链断裂（DSB）将通过单链退火（SSA）途径刺激侧翼重复序列之间的重组，产生缺失。以前，使用不同长度的同源序列的SSA的效率是在与远离DSB的较大重复的效率竞争的情况下测量的，这确保了如果不使用较小的区域，几乎所有细胞都能在DSB中存活（N.Sugawara和J.E.Haber，Mol.Cell.Biol.12:563-5751992）。在没有竞争的情况下，63-205bp同源片段参与SSA的效率显著提高。0.2%的时间使用了一个小到29 bp的序列，同源性依赖性在415 bp左右近似呈线性，在该大小下几乎所有细胞都存活下来。RAD52的同源物RAD59缺失的突变体SSA有缺陷，特别是当同源序列长度较短时；然而，即使使用1.17-kb基板，SSA也减少了四倍。DSB诱导的基因转化也显示出对Rad59p的部分依赖性，当同源序列长度较短时，该依赖性也最大。我们发现，当Rad59p侵入同源DNA模板时，它在从单链DNA末端移除非同源序列方面发挥了作用，其方式与之前在srs2突变体中看到的方式类似。Deltarad59对DSB诱导的基因转化的影响与msh3和msh2不同，后者在去除DSB诱导基因转化和SSA中的非同源末端方面也存在缺陷。一个msh3 rad59双突变体在SSA中的缺陷比任何一个单突变体都严重。

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数字

图1
图1
单品牌退火模型。当体内产生双链断裂时，DSB每侧的一条链在5′到3′方向被切除，留下3′的尾巴。当相对侧的互补序列暴露时，它们可以退火，形成支链中间体。单链尾部被核酸酶去除，间隙被填满，剩余的缺口被结扎，最终形成缺失产物。
图2
图2
重复序列之间的竞争。（A） 由Hin公司dIII限制性片段包含URA3公司建造（开放箱）。三重基板具有乌拉3-52序列（a）、205-bp序列（b）和URA3 Hin公司dIII限制性片段（c）。干预序列来自pUC9、lambda噬菌体和来自材料一(51). HO切割位点的DSB在重复序列之间启动SSA，并导致两个缺失产物，即A/c和b/c。在两个重复序列的底物中，只生成b/c产物。标记d、e和f的引物用于根据PCR分析的结构筛选菌落（见正文）。结构从着丝粒远端指向着丝粒近端（从左到右）。（B） 在HO诱导前和诱导后5 h，从tNS1379（双重复株）和tNS62（三重复株）中制备DNA用于Southern分析。探针的位置和Bgl公司用于Southern blot的II个位点如面板A所示。对于双重复株，Southern-blot显示诱导前的未分离DNA带，诱导后0.5小时的HO-叶带（4.8 kb）和5小时的产物带（5.5 kb）。三重复株产生了未分离的DNA带（9.3 kb）和两条产物带（2.9 kb和6.6 kb。
图3
图3
SSA的同源序列长度依赖性。含有双重复底物的菌株（图2A）是用不同数量的同源DNA构建的。测试的大小为29、63、89、205、235、415和1170 bp。如材料和方法中详细描述的那样，通过量化产物带，除以未切割的未诱导带的数量，并归一化为独立带（用吕2)以及包含GAL:：HO质粒。如本文所述，对具有29bp重复的菌株tNS709进行单独分析，以排除NHEJ和再结合事件以及未诱导的细胞（野生型[WT]）。
图4
图4
的影响雷达51和雷达59SSA突变。SSA在野生型（WT；tNS1379）中启动，雷达51（tNS1597），以及雷达59（tNS1573）背景，使用重复205-bp的双重复基板尿酸3序列（黑盒）。用2%半乳糖诱导培养5小时。DNA样本用Bgl公司II并用相邻序列进行探测尿酸3（交叉阴影框），显示未分离序列（8.4 kb）、HO切割序列（4.8 kb”）和产物带（5.5 kb）。
图5
图5
a中的SSA雷达59 msh3双突变体。（A） HO内切酶通过在415-bp序列（黑盒）之间切割尿酸3，导致删除产品。（B） 野生型（WT；tNS759），立方米（tNS1551），雷达59（tNS1789），以及msh3 rad59（tNS1967）菌株用半乳糖诱导5小时。在0和5小时时，获取DNA样本，用Bgl公司二、 并用邻近的序列进行探测尿酸3（图A中的交叉影线框），显示未切割的条带（8.6kb）、HO切割的片段（4.8kb）和产物条带（5.5kb）。
图6
图6
Rad59p在DSB诱导的基因转化中起作用。一系列包含不同长度同源序列的五种质粒材料用HO内切酶在体内切割α；用捐赠者切下的伤口材料α-inc序列修复DSB。由于同源性有限或由于雷达59突变会使质粒丢失。细胞在YP-乳酸培养基中生长，并置于含有半乳糖或葡萄糖的培养基上，对菌落的（Ura+)质粒。频率（见材料和方法）与1个标准偏差（误差条）相对应的同源序列总长度绘制。
图7
图7
的影响雷达59DSB诱导的基因转化中去除非同源尾的突变。（A） 质粒pFP122包含两个lacZ公司含嵌入117-bp HO切割位点的层序源自材料一较低的HO切割位点包含单点突变，使其不可清除并允许其作为供体序列。pFP121、pFP118、pFP140和pFP120被设计用于在DSB诱导后在两侧产生不同数量的非同源单链尾。黑色条显示删除的范围lacZ公司和HO切割位点序列（以核苷酸标记）。（B） 将含有pFP122、pFP121、pFP118、pFP140或pFP120的培养物置于富培养基（YPD）和半乳糖培养基（-半乳糖）上，使其生长成菌落，并对质粒的保留进行评分（Ura+殖民地）。按照材料和方法中的描述计算质粒保留频率。WT，野生型。
图8
图8
的影响srs2型SSA突变。SSA在野生型（WT；tNS1379）和开关磁阻传感器2突变体（tNS1585），通过使用具有205bp重复的两个重复底物尿酸3顺序如图4图例所示。用半乳糖诱导HO内切酶基因表达5小时，DNA样品进行Southern分析，如图4图例所示，显示未分离序列（8.4 kb）、HO切割序列（4.8 kb，以及产物带（5.5 kb）。
图9
图9
证明非同源尾如何阻碍DSB诱导的基因转化的模型雷达59突变体。（A） 在DSB诱导的基因转换过程中，单链DNA中间产物搜索双链DNA中的同源序列，并最初形成一个副链连接，然后转换为全链连接。侵入链末端存在的非同源序列会破坏副腱关节的稳定性或阻碍向全腱关节的转化（43）。Rad59p（闭合椭圆）通过退火绞线和稳定接头来促进该过程。一个稳定的副臂关节反过来为尾巴的移除或拓扑异构酶的作用提供了机会。在没有Rad59p的情况下，较长的尾巴对形成完整关节构成更大的阻碍。这与之前对开关磁阻传感器2突变，在DSB诱导的基因转化试验中表现类似（38）。Srs2p（黑色三角形）被提议通过解开供体复合体来稳定相同的结构，从而更容易形成副瓣关节，随后形成全瓣关节。（B） 当非同源尾变长时，它们可能通过在微同源序列退火介导的过程中形成二级结构来阻止SSA或DSB诱导的基因转换。单链DNA结合蛋白RPA（开放椭圆）可以通过与单链DNA形成复合物来减少二级结构。当单链尾搜索同源序列时，这些复合物可能与未结合态处于平衡状态。因此，二级结构仍然是成功SSA或基因转化的竞争对手。突变，如雷达59或开关磁阻传感器2削弱SSA或基因转换的因素将使平衡向二级结构转移，最终导致细胞死亡。具有短尾或无尾的底物没有这种竞争途径，因此它只在突变背景中以长尾结构显示自己。中的突变开关磁阻传感器2将SSA降低到比实际更低的程度雷达59突变，这与互补链退火不需要解旋酶的可能性一致。Srs2p可通过解卷基于微同源性的二级结构或通过解卷不当退火的单链尾部来帮助同源性搜索过程，间接促进SSA。
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