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.2000年1月；20(1):273-85.
doi:10.1128/MCB.20.1273-285.2000。

E2F1转录因子和p14（ARF）肿瘤抑制因子对衰老检查点反应的调节

G P迪姆里 1, K伊塔哈纳, M Acosta公司, J坎皮西
附属公司

E2F1转录因子和p14（ARF）肿瘤抑制剂对衰老检查点反应的调节

G P迪姆里等人。 分子细胞生物学. 2000年1月.

摘要

正常细胞不会由于一个称为复制衰老的过程而无限期分裂。当人类细胞因细胞分裂而获得一个或多个极短的端粒时，细胞会因衰老表型而停止生长。最近的证据表明，某些类型的DNA损伤、染色质重塑以及Ras或Raf的致癌形式也会引起衰老反应。我们在这里表明，E2F1是一种结合视网膜母细胞瘤（pRb）肿瘤抑制因子的多功能转录因子，可以促进或抑制肿瘤的发生，当在正常人类成纤维细胞中过表达时，它会诱导衰老表型。正常人细胞对E2F1的反应稳定地阻止了增殖并表达了一些复制性衰老标记。E2F1的这种活性独立于其pRb结合活性，但依赖于其刺激基因表达的能力。对衰老反应至关重要的E2F1靶基因似乎是p14（ARF）肿瘤抑制剂。复制性衰老的人成纤维细胞过度表达p14（ARF），p14（ARF）在早期细胞中的异位表达诱导了与E2F1诱导的表型相似的表型。与p14（ARF）的关键作用一致，p53功能受损的细胞对E2F1诱导的衰老具有免疫性，p14缺陷的细胞也一样。我们的研究结果支持衰老反应是一种关键的肿瘤抑制机制的观点，为E2F1在肿瘤发生中的明显矛盾作用提供了解释，并确定p14（ARF）是衰老表型的潜在重要介体。

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数字

图1
图1
本研究中使用的E2F1蛋白分析。（A） 文中描述的野生型（WT）和突变型（E132，CterSt，D423G，CterDl）E2F1蛋白图。（B） 表达式级别。正常（WI-38）或E6-expressing（WI-38-E6）人成纤维细胞感染了对照（B0）或E2F1表达的逆转录病毒（B-WT、B-E132、B-CterSt、B-D423G、B-Cter Dl）。抗生素筛选一代后制备蛋白裂解物，并通过Western blotting分析E2F1和QM（对照）（18）蛋白的水平。两种E2F1蛋白物种的存在具有略微不同的迁移率（在E6表达细胞中更为显著），与磷酸化和非磷酸化形式一致。在我们的SDS-PAGE条件下，野生型和突变型E2F1蛋白以几乎相同的迁移率迁移，尽管大小略有不同。对于WT、E132和D423G，E2F1蛋白的估计大小为52 kDa；CterSt为46 kDa；CterDl为59 kDa（由于从载体中添加了58个C末端氨基酸）。（C） pRb-结合活性。将WI-38-E6细胞感染对照或表达E2F1的逆转录病毒，通过血清剥夺使其静止（以减少内源性E2F1），然后裂解。然后，用抗E2F1抗体免疫沉淀500μg蛋白裂解物，并通过Western blotting（IP/Western）分析pRb。同时，在没有免疫沉淀（Western）的情况下分析15μg蛋白质的pRb和α-微管蛋白（对照）。（D） 交易激活活动。感染对照或E2F1表达病毒的E6表达细胞与标准化载体和无启动子荧光素酶载体pGL2或E2F-luc共同转染，其中荧光素酶由E2F结合位点驱动（42）；按照材料和方法中的描述制备和分析提取物。结果显示，归一化E2F-luc活性的数量相对于归一化pGL2活性的数量。
图2
图2
E2F1蛋白对细胞增殖、DNA合成和凋亡的影响。（A） 正常人体细胞的增殖。WI-38正常人成纤维细胞（预感染；2×105细胞）被模拟感染（mock）或感染对照（B0）或E2F1表达（野生型[WT]、E132、CterSt、D423G、CterDl）逆转录病毒。感染三天后，测定细胞数（预选）。然后用嘌呤霉素筛选感染细胞5天，并在不含抗生素的培养基中再培养3天；mock感染细胞在不使用抗生素的情况下培养8天。然后再次确定单元格编号（Postselect）。在使用不同批次病毒的至少三个独立实验中也获得了类似的结果。（B） 正常人体细胞中的DNA合成。感染WI-38细胞（感染前）并按照面板A所述进行选择。选择后[三H] 在无抗生素培养基中加入胸腺嘧啶核苷，3天后处理细胞进行放射自显影（Postselect）。对至少200个细胞进行计数，以确定放射性标记细胞核的百分比（%LN）。（C） E6表达的人类细胞的增殖。如材料和方法（WI-38-E6细胞）所述，用携带E6的LXSN逆转录病毒感染WI-38细胞，并在G-418中选择。随后，用表达E2F1的逆转录病毒感染产生的WI-38-E6培养物，这些逆转录病毒在嘌呤霉素中选择，并按照正常WI-38细胞的描述进行计数（A）。（D） 正常人和永生小鼠细胞的凋亡。如材料和方法所述，WI-38和小鼠NIH 3T3成纤维细胞感染对照（B0）或E2F1-表达（B-WT）逆转录病毒。72小时后，通过温和离心收集分离的（漂浮的）细胞。从漂浮细胞和剩余附着细胞中分离DNA，并按照材料和方法进行分析。如果在DNA分离之前在嘌呤霉素中选择WI-38细胞（未显示），则也不会出现DNA片段。左车道，DNA大小标记。（E） 正常人体细胞的凋亡。将WI-38细胞感染对照（B0）或E2F1-表达（B-WT）逆转录病毒，在嘌呤霉素中筛选3天，并将其涂布在有腔玻璃载玻片上；24小时后，用TUNEL原位检测DNA片段，然后用DAPI（4′，6′-二氨基-α-苯基吲哚）染色，如材料和方法所述。用10μM MG132处理HT1080细胞16小时，MG132是一种蛋白酶体抑制剂，可诱导人类肿瘤细胞（37）凋亡，作为反应的阳性对照。在>1000个B0-或B-WT感染的WI-38细胞中未观察到TUNEL阳性细胞（凋亡率<0.1%），而在MG132处理的HT1080细胞中611个TUNEL阴性细胞中有52个（凋亡率8.5%）。（F） E2F1生长停滞的稳定性。感染WI-38细胞并按照面板A所述进行选择。选择10后6细胞在无抗生素培养基中培养（第1天）。2天后（第3天）和9天后（第10天）测定细胞数量。
图3
图3
E2F1蛋白诱导衰老样表型。（A） 形态学和SA-β-Gal的表达。按照材料和方法中的描述，将WI-38细胞感染选定的E2F1表达的逆转录病毒，并在2至3天后对其进行SA-β-Gal染色。这些细胞是在相位控制光学下拍摄的。WT，野生型。（B） 基质重塑基因的表达。从如图A所述感染的WI-38细胞中分离的RNA，通过RT-PCR分析间质胶原酶（MMP-1）、基质溶素-1（Strom-1）、PAI-1和β-肌动蛋白（对照）mRNA，如材料和方法中所述。信号被归一化为β-肌动蛋白，对照细胞（B0）中MMP-1、基质溶素-1和PAI-1 mRNA水平均设为1。与B0相比，B-WT的诱导水平分别为2.7、2.2和1.8；B-E132的诱导水平分别为0.9、1.0和1.1；B-CterDl的诱导水平分别为0.9、1.2和1.0。
图4
图4
细胞周期蛋白E，p14的诱导农业研究基金和第16页INK4a公司通过E2F1蛋白。（A） 从感染了E2F1逆转录病毒（WT，野生型）的后选WI-38细胞中分离出细胞周期蛋白E RNA，并通过半定量RT-PCR分析β-actin（对照）和细胞周期蛋白E mRNA。与B0相比，cyclin E的诱导水平如下：B-WT，3.2；B-E132，1.2；B-CterSt，1.3；B-D423G，3.1；B-CterSt，1.2。（B） 第14页农业研究基金提取RNA，分析p14农业研究基金和β-actin，并按照面板A所述进行归一化。相对于B0，p14的诱导水平农业研究基金如下：B-WT，5.7；B-E132，1.6；B-CterSt，0.9；B-D423G，5.5；B-CterSt，1.0。（C） 第16页INK4a公司提取RNA，分析p16INK4a公司和β-肌动蛋白，并按照面板A所述进行归一化。p16INK4a公司在与p14相同的实验中进行了分析农业研究基金和具有相同的β-肌动蛋白（B）控制。（D） p14的表达农业研究基金在早期、衰老和逆转录病毒感染的细胞中。RNA是从早衰（Presen）和衰老（Sen）WI-38细胞以及感染p14的WI-38细胞中分离出来的农业研究基金逆转录病毒，细胞在含血清培养基中培养。按照A组和p14的描述，对RNA进行分析和归一化农业研究基金衰老细胞的表达设为1。相对于衰老细胞，p14农业研究基金早逝细胞中的表达水平为0.15，逆转录病毒感染细胞中的表达水平为3。
图5
图5
p14诱导的衰老表型农业研究基金（A）生长抑制。细胞数量在感染前由对照组（B0）或p14测定农业研究基金-表达（B-ARF）逆转录病毒（预感染）、选择前（预选）和选择后（后选），如图2A的图例所示。还提供了后选单元格[三H] 胸腺嘧啶核苷72h，以测定能够合成DNA的细胞比例（%LN）。（B） 形态学和SA-β-Gal的表达。对后选细胞进行SA-β-Gal染色，并在相控光学下拍照。（C） 基质重塑基因的表达。从后选择的WI-38细胞以及早衰和衰老的WI-38mRNA中分离出RNA，并通过半定量RT-PCR分析肌动蛋白（对照）mRNA和间质胶原酶（MMP-1）、基质溶素-1（Strom-1）和PAI-1 mRNA。定量见表2。（D） 14诱导p53和p21农业研究基金和E2F1。从后选细胞制备蛋白质提取物，并通过Western blotting分析p53、p21和微管蛋白（对照）。
图6
图6
E2F1和p14诱导的衰老表型农业研究基金依赖于p53。（A） 第14页农业研究基金在正常和E6表达细胞中表达。WI-38-E6细胞感染对照（B0）或p14农业研究基金-表达（B-ARF）逆转录病毒并进行筛选。从后选细胞中分离RNA，并通过RT-PCR分析肌动蛋白（对照）和p14农业研究基金mRNA。为了进行比较，显示了对正常WI-38细胞进行的相同分析。（B） p14抑制生长农业研究基金在E6表达细胞中。感染WI-38-E6细胞，并如图A所述进行选择。在感染（预感染）和选择（预选择）之前和选择（后选择）之后测定细胞数。后选单元格标记为[三H] 胸腺嘧啶核苷72h。至少对200个细胞进行计数，以确定放射性标记细胞核的百分比（%LN）。（C） 形态学和SA-β-Gal表达。对挑选后的WI-38-E6细胞进行SA-β-Gal染色，并在相控光学下拍照。（D） Mdm2表达。从在0.2（−血清）或10%（+血清）血清中保存3天的早衰WI-38细胞中制备蛋白质提取物，增殖细胞感染表达对照（B0）或Mdm2（B-Mdm2）的逆转录病毒。通过Western blotting分析提取物中的Mdm2和QM（对照）蛋白。（E） Mdm2表达细胞的生长抑制。WI-38细胞被G-418中选择的对照（L0）或表达Mdm2（L-Mdm2）的病毒感染，并与对照（B0）、p14重叠感染农业研究基金（B-ARF）或野生型E2F1[WT（E2F1）]病毒，并在嘌呤霉素中选择。在感染前（感染前）和选择前（选择前）以及选择后3天（选择后）对细胞进行计数。
图7
图7
E2F1诱导的衰老表型为p14农业研究基金依赖。（A） U2OS细胞用对照（B0）-、野生型E2F1（B-WT）-、反式激活缺陷的CterD1 E2F1（B-CterD1）-或p14感染农业研究基金（B-ARF）-表达逆转录病毒并在嘌呤霉素中选择。细胞计数或标记[三H] 胸腺嘧啶核苷3天，以确定感染前（感染前）、选择前（选择前）或选择后2至3天（选择后）合成DNA的百分比（%LN）。同时，在感染前（感染前）和选择后（选择后）对细胞进行SA-β-Gal活性染色。每次测定标记细胞核百分比和SA-β-Gal活性时，至少从两个独立培养皿中计数400个细胞。（B） 如U2OS细胞（A）所述，感染A375细胞并分析细胞数量、标记细胞核百分比和SA-β-Gal活性。（C） 从感染对照（B0）、野生型E2F1（B-WT）、CterDl E2F1（B-CterDl）或p14的后选U2OS细胞中制备蛋白裂解物农业研究基金表达（B-ARF）的逆转录病毒并通过Western blotting分析p53、p21、E2F1、p14农业研究基金和QM（对照）蛋白。
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