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.1999年12月；10(12):4403-17.
doi:10.1091/mbc.10.12.4403。

类动力蛋白DLP1对哺乳动物细胞内质网和线粒体的正常分布和形态至关重要

K R皮茨 1, Y Yoon公司, E W克鲁格, M A麦克尼文
附属公司
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类动力蛋白DLP1对哺乳动物细胞内质网和线粒体的正常分布和形态至关重要

K R皮特斯等。 分子生物学细胞. 1999年12月.
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摘要

大GTPase的dynamin家族与质膜和各种细胞内膜室的囊泡形成有关。最近在哺乳动物组织中发现的类动力蛋白DLP1与酵母动力蛋白Vps1p和Dnm1p（42%）的关系比与哺乳动物动力蛋白（37%）的联系更为密切。此外，DLP1与哺乳动物细胞中与微管和内质网（ER）密切接触的点状小泡有关。为了确定DLP1的功能，我们在培养的哺乳动物细胞中瞬时表达了野生型和两种突变的DLP1蛋白，并用绿色荧光蛋白标记。DLP1（K38A和D231N）GTP结合域的点突变显著改变了其细胞内分布，从点状囊泡结构变为聚集或弥散模式。引人注目的是，通过免疫荧光显微镜观察，表达DLP1突变体的细胞或微量注射DLP1抗体的细胞显示ER荧光显著降低，线粒体显著聚集和微管化。与这些观察结果一致，DLP1突变细胞的电子显微镜显示线粒体和内质网的分布和形态发生了显著的定量变化。这些数据支持了其他作者最近的研究，这些研究表明DLP1在维持酵母和哺乳动物细胞的线粒体形态方面起着重要作用。此外，本研究提供了第一个证据，证明动态蛋白家族成员参与了内质网的维持和分布。讨论了DLP1如何参与两个可能不同的细胞器系统的生物发生。

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数字

图1
图1
GFP标记的WT、K38A和D231N显示不同的定位。（A） 全长未标记DLP1的示意图，其中N端GTP绑定元素表示为黑盒。第一和第三元素的氨基酸序列被放大，GFP标签位于每个结构的N末端。WT表示野生型GFP-DLP1，并且GFP标记的点突变体被称为K38A和D231N。当在克隆9细胞中瞬时表达时，这些蛋白显示出明显不同的细胞分布。WT DLP1分布于点状囊泡状结构（B，箭头），类似于内源性DLP1的分布。相反，K38A（C）积累成大的聚集物（箭头）和较小的点状病灶（箭头），与WT细胞中观察到的类似。D231N呈现弥散的胞质分布（D），表明失去了膜靶向性。N、 核心。棒材，10μm。
图2
图2
DLP1突变体不影响内吞作用。将单独表达GFP载体、WT、K38A或D231N的克隆9细胞与德克萨斯红缀合的葡聚糖或DiI-LDL孵育，固定，并通过荧光显微镜观察。细胞质中含有荧光标记的细胞被计数为标记摄取阳性。转染细胞的定量显示，相对于仅表达GFP载体的细胞，DLP1突变体不影响右旋糖酐（白色条）或LDL（灰色条）的内吞作用。使用Alexa-conjugated transferrin对转染细胞进行的时程实验表明，DLP1突变表达细胞在2、5、10或20分钟时与未转染细胞无法区分（我们的未发表结果）。数据表示为仅表达GFP载体的细胞的标准化摄取百分比。
图3
图3
抑制DLP1功能导致线粒体和ER表型异常。转染GFP-DLP1-K38A或GFP-DLP2-D231N或微量注射抑制性DLP1抗体的细胞用线粒体抗体（二氢硫酰胺乙酰转移酶）和ER（PDI）进行免疫染色。（A） 表达K38A的细胞显示出均匀点状DLP1结构的减少和大聚集体的出现。在同一细胞中，线粒体似乎向细胞中心塌陷，形成围绕细胞核的长小管（A′，箭头），并失去在相邻未转染对照细胞中观察到的离散大小和形状。与相邻的未转染对照细胞（A“）相比，这些突变细胞中的ER染色明显减少。（B）表达D231N的细胞与表达K38A或内源性DLP1的细胞呈弥散分布，且分布明显不同。尽管突变D231N蛋白的分布存在差异，但这些细胞显示出与K38A表达细胞中相同的异常线粒体（B′，箭头）和ER（B“）表型。（C）注射DLP1抗体的细胞。下部细胞显示级联蓝-结合右旋糖酐集中在细胞核和外周细胞质中，证实注射成功。同一注入细胞的线粒体染色显示，细胞核周围的长管状结构（C′，箭头）塌陷，类似于突变细胞中观察到的异常线粒体。注意细胞核（C“）周围ER的塌陷和染色强度的降低，如突变细胞。N，转染或注射细胞的细胞核。Bar，10μm。
图4
图4
DLP1突变表达细胞或DLP1抗体注射细胞线粒体和ER表型改变的定量。（A） 通过生成与线粒体离散性相对应的对象来量化线粒体表型（见材料和方法）。对这些对象进行计数，数据表示为线粒体的平均数量±95%置信区间。突变细胞（点状条）中的离散线粒体比对照细胞（白色条）中少。注射抑制性DLP1抗体的细胞（注射，点状条）与对照注射的细胞（Coninj，白色条）相比，显示出类似的降低值。（B） 通过测量ER染色细胞的总细胞质荧光来量化ER表型（见材料和方法）。在突变细胞（点状条）中，与对照细胞（白色条）相比，观察到总ER荧光显著降低。与对照注射的细胞（Coninj，白条）相比，注射了抑制性DLP1抗体的细胞（Inj，点画条）显示出类似的减少。在转染后16小时或注射后8小时收集细胞数据。
图5
图5
表达DLP1突变蛋白的细胞表现出多种ER标记评估的ER异常。转染并表达未标记DLP1-K38A（A和B）或GFP-DLP1-D231N（C和D）的细胞用钙网蛋白（可溶性内质网腔标记物（A和C）或内质网跨膜蛋白Sec61β（B和D）进行免疫染色。在每种情况下，DLP1功能缺陷的细胞都显示出总ER荧光减少，这与用可溶性ER管腔标记物PDI染色的DLP1缺陷细胞获得的荧光定量数据一致（见图4B）。星号，突变表达细胞。棒材，10μm。
图6
图6
DLP1缺陷细胞内质网和线粒体分布及形态变化的电子显微镜。对照组未注射细胞、核注射GFP-DLP1-K38A后固定16-24小时的细胞或注射抑制性DLP1抗体的细胞的选定透射电镜图像。在对照细胞中，细胞质充满了相互连接的粗ER（A，箭头）长链，其间散布着大小均匀的线粒体（A，箭）。高倍放大可以分辨出这些常见细胞器的正常形态（B、箭头和箭头）。相反，注射GFP-DLP1-K38A（C和D）或抑制性DLP1抗体（E和F）的细胞显示线粒体塌陷到核周区域（C和E，箭头）。这些细胞在靠近核膜（C和E，箭头）处具有缩短的、不明确的内质网轮廓，并且细胞质大而完全没有内质网（比较A、C和E）。高倍镜下，内质网池不太清晰，靠近线粒体，线粒体肿胀、拉长、分枝，嵴高度分离（D和F，箭头）。棒材，1μm。
图6
图6
电子显微镜观察DLP1缺陷细胞中ER和线粒体分布和形态的变化。对照组未注射细胞、核注射GFP-DLP1-K38A后固定16-24小时的细胞或注射抑制性DLP1抗体的细胞的选定透射电镜图像。在对照细胞中，细胞质充满了相互连接的粗ER（A，箭头）长链，其间散布着大小均匀的线粒体（A，箭）。高倍放大可以分辨出这些常见细胞器的正常形态（B、箭头和箭头）。相反，注射GFP-DLP1-K38A（C和D）或抑制性DLP1抗体（E和F）的细胞显示线粒体塌陷到核周区域（C和E，箭头）。这些细胞在靠近核膜（C和E，箭头）处具有缩短的、不明确的内质网轮廓，并且细胞质大而完全没有内质网（比较A、C和E）。高倍镜下，内质网池不太清晰，靠近线粒体，线粒体肿胀、拉长、分枝，嵴高度分离（D和F，箭头）。棒材，1μm。
图6
图6
电子显微镜观察DLP1缺陷细胞中ER和线粒体分布和形态的变化。对照组未注射细胞、核注射GFP-DLP1-K38A后固定16-24小时的细胞或注射抑制性DLP1抗体的细胞的选定透射电镜图像。在对照细胞中，细胞质中充满了相互连接的粗内质网（A，箭头）的长链，其中散布着大小均匀的线粒体（A，箭头）。高倍放大可以分辨出这些常见细胞器的正常形态（B、箭头和箭头）。相反，注射GFP-DLP1-K38A（C和D）或抑制性DLP1抗体（E和F）的细胞显示线粒体塌陷到核周区域（C和E，箭头）。这些细胞在靠近核膜（C和E，箭头）处具有缩短的、不明确的内质网轮廓，并且细胞质大而完全没有内质网（比较A、C和E）。高倍镜下，内质网池不太清晰，靠近线粒体，线粒体肿胀、拉长、分枝，嵴高度分离（D和F，箭头）。棒材，1μm。
图7
图7
对照组与GFP-DLP1-K38A注射细胞ER和线粒体图谱的空间分析。两个对照细胞或两个表达GFP-DLP1-K38A的细胞的ER和线粒体的追踪。（A） 对照细胞呈现出大量内质网轮廓（蓝色）和线粒体（红色）的均匀分布。（B） 相反，表达GFP-DLP1-K38A的细胞表现出ER图谱数量显著减少（蓝色），线粒体明显塌陷、肿胀和管状化（红色）。Nuclei以绿色显示。
图8
图8
GFP-DLP1-K38A注射细胞ER和线粒体表型的超微结构定量。如图7所示，追踪ER和线粒体剖面，并计算五个对照细胞和五个K38A表达细胞的总ER和线粒体体积密度，如材料和方法所述。数据以总细胞体积密度±SEM的百分比表示。在突变细胞中，线粒体总体积密度（灰色条）比对照增加了43%。引人注目的是，突变细胞的内质网总体积密度（点状条）下降了80%。
图9
图9
DLP1沿线粒体定位。DLP1（红色）和线粒体（绿色）克隆9细胞的免疫荧光双重标记显示DLP1阳性结构（A和B，箭头）沿线粒体排列。请注意，尽管这种结构关联令人信服（C，箭头），DLP1阳性结构大多为细胞质结构，呈线状排列（C，箭头），不存在线粒体。DLP1的这些线性、非线粒体阵列以前已经显示为代表微管和内质网池。棒材，2μm。
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