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.1999年10月18日；147(2):221-34.
doi:10.1083/jcb.147.2.221。

PML对ND10的形成至关重要，当被SUMO-1修饰时，PML相互作用蛋白daxx被招募到这个核结构中

A M伊斯霍夫 1, A G索特尼科夫, D内格罗夫, O V弗拉基米罗娃, N内夫, T Kamitani公司, E T Yeh公司, J F斯特劳斯三世, G G摩尔
附属公司

PML对ND10的形成至关重要，当被SUMO-1修饰时，PML相互作用蛋白daxx被招募到这个核结构中

A M伊斯霍夫等。 J细胞生物学. .

摘要

核结构域10（ND10）也称为核体，是包括早幼粒细胞白血病蛋白（PML）和Sp100在内的几种蛋白质的离散染色体间积累。在本研究中，我们通过使用缺乏单个ND10-相关蛋白的细胞系来识别对这一过程至关重要的蛋白质，从而研究ND10组装的机制。我们鉴定了适配器蛋白Daxx和BML，即Bloom综合征中缺失的RecQ解旋酶，作为新的ND10-相关蛋白。研究发现，PML（而非BLM或Sp100）负责所有其他ND10-相关蛋白的正确定位，因为它们分散在PML-/-细胞中。通过瞬时表达或与PML产生细胞融合将PML引入该细胞系，将ND10相关蛋白招募到从头形成的ND10中，证明PML在ND10形成中的本质。在没有PML的情况下，Daxx在浓缩染色质中高度富集。它从浓缩染色质招募到ND10需要PML的小泛素相关修饰物（SUMO-1）修饰，并反映Daxx和PML的COOH末端结构域之间的相互作用。由于SUMO-1-修饰的PML积累增加，在没有PML的情况下Daxx从浓缩染色质分离到ND10，这表明这两个核位点之间存在可变平衡。我们的研究结果确定了ND10形成的基本要求，并提出了由PML的SUMO-1修饰状态控制的这些核结构域蛋白质补充的动态机制。

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图1
图1
ND10维护不需要ND10的新组件、BLM解旋酶以及Sp100。不同细胞的共焦显微照片显示，标记的蛋白质位于上角。单元格类型显示在图像的下部。（A–C）HF双标记BLM蛋白（A）和PML（B）；合并后的图像显示这两种蛋白质共定位（C）。（D–F）Bloom综合征成纤维细胞（BF）BLM（D）和PML（E）双重标记；BLM抗体（F）没有ND10标记。（G–I）NT2细胞双重标记Sp100（G）和PML（H）；Sp100（I）没有ND10标签。（J） Western blot分析以确定NT2（车道1、2、5和6）和HEp-2细胞（车道3、4、7和8）中是否存在Sp100（车道1-4）和PML（车道5-8）。IFNα+代表干扰素α处理的细胞。星号标记抗PML抗体识别的非特异性蛋白质。它表示蛋白质负荷相等。箭头标记着最丰富的Sp100和PML信号。高分子量多肽代表蛋白质的选择性剪接或转录后修饰（通过SUMO-1或磷酸化）。可以清楚地看到，NT2细胞在正常和IFNα上调的条件下（通道1和2）不表达Sp100，而在HEp-2细胞中，IFNα的上调导致Sp100信号的急剧增加（通道3和4）。内源性和IFNα上调的PML存在于两种细胞系（5-8道）中。
图2
图2
PML负责所有其他ND10-相关蛋白的正确定位。免疫标记蛋白的共焦显微照片在图像的上角显示了各自的颜色。图像下部显示了细胞类型和过度表达的蛋白质。（A） 标记Sp100和PML的MPEF细胞；主要ND10相关蛋白存在于小鼠ND10中。（B） MPEF细胞双标记NDP55；鼠标ND10包含NDP55。C.双重标记SUMO-1和PML的MPEF细胞；小鼠ND10含有SUMO-1修饰蛋白。D–H表示与上图中相同的字段，强调ND10中相应蛋白质的最高浓度。（G） 标记为Sp100的PML−/−MPEF细胞仅在没有PML的情况下分散在细胞核中。（H） 标记NDP55的PML−/−MPEF细胞；NDP55分散在细胞核中。（一） 标记SUMO-1的PML−/−MPEF细胞；SUMO-1分散在细胞核中。（J） PML转染的（左上下细胞）PML−/−MPEF标记为Sp100和PML，表明Sp100被招募到ND10-like位点。（K） PML转染（右、上、下细胞），标记NDP55和PML的PML−/−MPEF；NDP55被招募到类似ND10的位点。（五十） PML转染的PML−/−MPEF（左上下细胞）标记SUMO-1和PML；SUMO-1被招募到ND10-like站点。请注意，即使PML积聚在细胞质中，SUMO-1也有唯一的核定位。
图3
图3
新的ND10-相关蛋白Daxx及其在ND10破坏和重建时的定位。免疫标记蛋白的共焦显微照片在图像的上角显示了各自的颜色。图像下部显示了细胞类型和过度表达的蛋白质。标记Daxx（A）、PML（B）和这两种蛋白（C）的（A–C）MPEF细胞在ND10处共定位。（D） PML−/−MPEF细胞双标记着丝粒和PML；一些着丝粒与Daxx阳性位点相关，但大多数Daxx与着丝粒不在同一空间。（E–G）PML−/−MPEF细胞双重标记Daxx（E）和DNA（F），同时（G）显示Daxx位于没有PML的浓缩染色质处。（H–J）PML−/−MPEF细胞转染表达PML（上层细胞）并标记PML（H）、Daxx（I）和这两种蛋白（J）；Daxx位于PML阳性位点，与未转染细胞相反，核质中几乎没有Daxx，并且在类似浓缩染色质的位点无法识别。（K–N）PML−/−MPEF细胞与HF融合，并进行DNA（K）染色，通过浓缩染色质的DNA染色鉴定小鼠来源的下部和左侧上部细胞，右侧上部细胞为人类。PML染色显示在L中，Daxx染色显示在M中。在合并图像（N）中，左上方的小鼠细胞显示包含人类PML，因此与HF融合。在融合的小鼠细胞中，Daxxx不仅存在于小鼠下部细胞的浓缩染色质中，还存在于ND10-like结构域中。
图4
图4
转染时GFP融合的野生型Daxx和Daxx突变体的定位。共焦显微照片显示了由表达Daxx和Daxx突变体的质粒瞬时转染的HEp-2细胞与GFP融合，并经PML（A、D和G）和GFP（B、E和H）染色。合并的图像显示在C、F和I中。过度表达的蛋白质显示在图像的下部。（A–C）HEp-2细胞转染GFP-NLS融合的野生型Daxx后16 h；瞬时表达的Daxx聚集在PML阳性位点。（D–F）HEp-2细胞转染Daxx 1-595后16 h融合到GFP-NLS；这种COOH末端缺失突变不会在PML阳性位点积累。（G-I）HEp-2细胞转染融合GFP-NLS的Daxx 624-740后16 h；瞬时表达的Daxx COOH末端片段积聚在PML阳性位点，但也充满了核质。
图5
图5
PML的SUMO-1修改对Daxx本地化非常重要。免疫标记蛋白的共焦显微照片在图像的上角显示了各自的颜色。图像下部显示了细胞类型和过度表达的蛋白质。（A和E）PML转染的HEp-2细胞双重标记SUMO-1和PML（A）或SUMO-1（E）。SUMO-1和PML仅在细胞核内共定位。（B和F）转染HEp-2细胞以表达His标记的PMLΔSUMO和SUMO-1双重标记的三重SUMO-1位点缺失PML突变体（PMLΔSUMO）（B）或仅SUMO-1（F）；PMLΔSUMO在上面两个转染细胞的ND10样结构中积累；内源性SUMO-1指示ND10的位置。与A中野生型PML的大聚集体相比，右下角细胞的大核PMLΔSUMO聚集体中没有SUMO-1。左下角细胞没有转染。（C和G）PML转染的HEp-2细胞双标记Daxx和PML（C）或仅标记Daxx（G）；Daxx在PML阳性位点积累。用His-tagged PMLΔSUMO转染（D和H）HEp-2细胞，并双重标记Daxx和PML△SUMO（D）或仅Daxx（H）；与C中野生型PML转染相比，突变PML积累中没有Daxx。左上角细胞未转染。（I和J）HEp-2细胞双重转染表达PML和Daxx，并双重标记Daxx和PML（I）或仅标记Daxx（J）；Daxx和PML共定位，但仅在细胞核内。（K和L）Daxx和PMLΔSUMO双转染HEp-2细胞，双重标记Daxx及His-tagged PML△SUMO（K）或仅Daxx（L）；Daxx和PMLΔSUMO沉积在不同的空间。
图6
图6
ND10形成和维护的分级方案。PML公司S公司表示与SUMO-1共轭的PML；DNA M-Tase，DNA甲基转移酶。
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