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.1999年11月；19(11):7771-81.
doi:10.128/MCB.19.11.7771。

蛋白激酶Bbeta/Akt2在胰岛素刺激的脂肪细胞GLUT4易位中的作用

M M希尔 1, S F克拉克, D F塔克, M J Birnbaum先生, D E詹姆斯, S L麦考利
附属公司

蛋白激酶Bbeta/Akt2在胰岛素刺激的脂肪细胞GLUT4易位中的作用

M M山等。 分子细胞生物学. 1999年11月.

摘要

胰岛素通过促进葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）向细胞表面的移位，刺激葡萄糖进入肌肉和脂肪细胞。磷脂酰肌苷3-激酶（PI3K）参与了这一过程。然而，PI3K下游靶点蛋白激酶B（PKB）/Akt参与GLUT4易位的调控一直存在争议。在这里，我们报告了微量注射PKB底物肽或PKB抗体分别抑制胰岛素刺激的GLUT4向质膜移位66%或56%。我们进一步研究了用胰岛素或血小板衍生生长因子（PDGF）处理细胞后PKB亚型的激活，发现PKBbeta在大鼠和3T3-L1脂肪细胞中优先表达，而PKBalpha在3T3-LI脂肪细胞中表达下调。当3T3-L1成纤维细胞分化为脂肪细胞时，也观察到生长因子反应的转换。虽然PDGF在刺激成纤维细胞中PKB磷酸化方面比胰岛素更有效，但通过几种方法评估，PDGF并未在脂肪细胞中显著刺激PKBβ磷酸化。此外，胰岛素而非PDGF刺激PKBbeta向3T3-L1脂肪细胞的质膜和高密度微粒体部分移位。这些结果支持PKBbeta在胰岛素刺激的脂肪细胞葡萄糖转运中的作用。

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数字

图1
图1
微量注射PKB底物肽或N末端PKB抗体可抑制胰岛素刺激的GLUT4易位。盖玻片上的3T3-L1脂肪细胞在Krebs-Ringer碳酸氢盐-HEPES缓冲液中预孵育45至90分钟或以0.2 mg/ml微量注射纯化的N末端PKB抗体（PKB Ab）（N19；Santa Cruz）或纯化的兔IgG组分（对照Ab）。改变浸泡缓冲液，使细胞恢复60分钟。然后，按照材料和方法中的描述，在通过PM草坪试验评估PM GLUT4水平之前，用100 nM胰岛素刺激或不刺激细胞20分钟。结果来自四个或多个实验，在这些实验中，针对每个实验中的每个条件，测定了六个或更多领域中的GLUT4水平。*，P（P）与胰岛素刺激相比<0.01（配对t吨测试）。
图2
图2
生长因子反应的变化伴随3T3-L1脂肪细胞的分化。（A） 用1μM胰岛素（I）或50 ngPDGF/ml（P）刺激血清饥饿的3T3-L1成纤维细胞或脂肪细胞15分钟或不治疗（B）。通过SDS-PAGE和用磷酸化-Ser473（pSer473）或磷酸化-Thr308（pThr308）PKB抗体进行免疫印迹分析细胞裂解物（30μg）。（B） 从表达HA-PKBα或HA-PKBβ的3T3-L1成纤维细胞裂解物（100μg）中免疫沉淀HA-PKB a或HA-PKBβ，并通过SDS-PAGE进行分析。用绵羊PKBα、绵羊PKBβ或兔PKBβ抗体进行免疫印迹。（C） 用SDS-PAGE和羊PKBα或羊PKBβ抗体的免疫印迹法分析为A组制备的细胞裂解物（30μg）。标记为带1的带显示出相同的电泳迁移率。
图3
图3
脂肪细胞分化诱导PKBβ表达。（A） 在分化过程的每一天采集3T3-L1细胞，分别用羊PKBβ抗体或兔抗GLUT4抗体（R017）进行免疫印迹分析PKBβ（●）或GLUT4（○）的表达。免疫反应信号（以Lumi-Imager单位获得）根据每个样品获得的总蛋白进行调整，然后以最大值的百分比表示。结果代表了两个单独的实验。（B） 3T3-L1成纤维细胞在亚融合时（50%或90%）或达到融合后1天（对照后）采集。分化完成后第8天（adip）采集3T3-L1脂肪细胞。细胞裂解物（30μg）通过SDS-PAGE和羊PKBβ抗体免疫印迹分析PKBβ表达水平。
图4
图4
PKBβ是脂肪细胞中的主要亚型。（A） 用羊PKBβ抗体进行连续两轮免疫沉淀，去除血清饥饿的3T3-L1成纤维细胞（Fib）或3T3-LI脂肪细胞（Ad）的细胞裂解物（100μg）中的PKBβ。通过SDS-PAGE和羊PKBα或羊PKBβ抗体的免疫印迹分析20毫克裂解物（裂解物）和五分之一免疫沉淀上清液（PKBβ-IP后）。（B） 用1μM胰岛素（I）处理15分钟或左基底部（B）的分离大鼠脂肪细胞的细胞裂解物（100μg）耗尽PKBβ，并按照面板A所述进行分析。（C）用羊PKBβ抗体对100μg由过度表达HA-PKBα的3T3-L1脂肪细胞制备的细胞裂解液进行免疫沉淀。用单克隆HA抗体通过SDS-PAGE和免疫印迹分析免疫沉淀物（PKBβ-IP）和10μg裂解物（lysate）是否存在HA-PKBα。
图5
图5
胰岛素而非PDGF刺激3T3-L1脂肪细胞中PKBβ的磷酸化。（A） 从100μg 3T3-L1裂解液中免疫沉淀PKB亚型，3T3-LI裂解液由未刺激细胞（B）或用1μM胰岛素（I）或50 ngPDGF/ml（P）处理5或15分钟的细胞制备。在PKBα免疫沉淀的情况下，PKBβ首先通过连续两轮免疫沉淀从细胞裂解液中去除。用SDS-PAGE和免疫印迹法分析免疫沉淀物，分别用磷酸化-Ser473（pSer473）或磷酸化-Thr308（pThr308）PKB抗体或羊PKBβ抗体（PKBβ）。（B） PKBβ免疫沉淀自32使用羊PKBβ抗体，用1μM胰岛素（I）或50 ngPDGF/ml（P）处理15或左侧基底部（B）的P-标记3T3-L1脂肪细胞，并用SDS-PAGE进行分析。对聚偏二氟乙烯膜进行放射自显影（autorad.），然后用磷酸化-Ser473抗体（pSer473）进行免疫印迹。
图6
图6
通过2-DE分析3T3-L1脂肪细胞中胰岛素刺激的PKBβ磷酸化32用兔抗PKBβ抗体从细胞裂解液中免疫沉淀PKBβ，并通过2-DE和放射自显影术进行分析。用2-DE和兔抗PKBβ抗体免疫印迹法分析未经处理的3T3-L1脂肪细胞（C）或用1μM胰岛素处理15分钟的脂肪细胞（D）、50 ng/ml PDGF处理15分钟（E）或100 nM沃特曼蛋白处理40分钟（F）制备的裂解物（150μg）。面板A和B的聚偏二氟乙烯膜的免疫印迹结果与面板C和D的结果相似。
图7
图7
胰岛素而非PDGF刺激PKBβ向3T3-L1脂肪细胞膜组分的移位。用胰岛素（I）或PDGF（P）刺激3T3-L1脂肪细胞5或15分钟或左基底部（B）。按照材料和方法中的描述，通过差速离心将细胞均质并亚分离，以生成PM、HDM、HSP（也称为LDM）、胞浆（CYT）和线粒体核（M/N）部分。通过SDS-PAGE和羊PKBβ（PKBβ）或磷酸化-Ser473 PKB（pSer473）抗体的免疫印迹分析每个组分的20微克。
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