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.1999年7月15日；19(14):5782-91.
doi:10.1523/JNEUROSCI.19-14-05782.1999。

α-Synuclein与14-3-3蛋白具有物理和功能同源性

N奥斯特雷罗娃 1, 佩特鲁切利, M Farrer先生, N梅塔, P Choi先生, J哈代, B沃尔津
附属公司

α-Synuclein与14-3-3蛋白具有物理和功能同源性

N奥斯特雷罗娃等。 神经科学. .

摘要

α-Synuclein与许多神经退行性疾病的病理生理学有关，包括帕金森病（PD）和阿尔茨海默病（Alzheimer's disease）。α-同核蛋白突变导致一些家族性PD病例（Polymeropoulos等人，1997年；Kruger等人，1998年）。此外，许多神经退行性疾病显示，α-同核蛋白在营养不良的神经突和路易小体中积聚（Spialantini等人，1998年）。在这里，我们表明α-同核蛋白与14-3-3蛋白具有物理和功能同源性，14-3-3是普遍存在的细胞质伴侣家族。α-同核蛋白和14-3-3蛋白的区域具有40%以上的同源性。此外，α-同核蛋白与14-3-3蛋白以及一些已知与14-3-3-相关的蛋白结合，包括蛋白激酶C、BAD和细胞外调节激酶，但不与Raf-1结合。我们还表明，α-同核蛋白的过度表达抑制蛋白激酶C的活性。α-突触核蛋白与BAD的结合以及蛋白激酶C的抑制表明，α-突触核蛋白的表达增加可能是有害的。与这一假设一致，我们观察到野生型α-突触核蛋白的过度表达是有毒的，而含有A53T或A30P突变的α-突触素的过度表达表现出更大的毒性。α-突触核蛋白的活性和结合特征表明，它可能作为蛋白质伴侣，α-突触核蛋白的积累可能导致神经退行性疾病中的细胞死亡。

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数字

图1。
图1。
A类，α-突触核蛋白和14-3-3蛋白家族的比对。使用Multalin程序进行校准(http://www.toulouse.ina.fr/multalin.html). 为了观察同源性，我们在执行比对算法时排除了14-3-3蛋白的前30个氨基酸。精确匹配显示为白色字母在上黑色背景，具有类似性质的蛋白质的匹配如下所示黑色字母在上灰色背景此外，我们注意到在黑色因为这两种氨基酸都可以被丝氨酸/苏氨酸激酶磷酸化。B，α-突触核蛋白与14-3-3的结合。大鼠脑组织被分为细胞质(C类)和膜(M（M）)组分，在免疫沉淀缓冲液中吸收，并如图所示进行处理。这个左边显示了带有抗α-突触核蛋白抗体的14-3-3β免疫沉淀物的免疫印迹，以及正确的显示了裂解物的免疫印迹。省略车道标记为Ø是指使用蛋白A而非1°抗体进行的免疫沉淀。C类、左边显示了具有抗14-3-3ε抗体的α-突触核蛋白免疫沉淀的免疫印迹，并且正确的显示了裂解物的免疫印迹。省略车道标记为Ø是指使用蛋白A而非1°抗体进行的免疫沉淀。
图2。
图2。
大鼠脑组织中α-突触核蛋白与PKC亚型的关联。左侧面板显示α-突触核蛋白免疫沉淀与异型特异性PKC抗体的免疫印迹。右侧面板显示膜和细胞质组分中每个PKC亚型的免疫印迹。每次免疫沉淀前，用1μ米PMA加1米米钙2+在30°C下保持30分钟。然后将匀浆分为膜和细胞质组分，并在免疫沉淀缓冲液中提取，如图所示分离蛋白质。细胞质，C类; 膜，M（M）; 省略，Ø这是一种使用蛋白A而非1°抗体进行的免疫沉淀。
图3。
图3。
A类，用空载体稳定转染293株HEK细胞的免疫印迹(Vec公司)，野生型(重量)或使用α-synuclein抗体SC1的A53Tα-synuglein。对照293 HEK细胞内源性表达低水平的α-突触核蛋白(箭头)，而转染的细胞显示19kDaα-突触核蛋白的表达增加。B，α-突触核蛋白免疫沉淀物中PKCα的免疫印迹。用空载体稳定转染293株HEK细胞系(Vec公司)，野生型(重量)或A53Tα-突触核蛋白在基础条件下生长或用20 n米缓激肽30分钟，用琼脂糖偶联的抗FLAG树脂对裂解产物进行免疫沉淀。用抗PKCⅢ型抗体对所得样品进行免疫印迹显示，只有在缓激肽处理的样品中，α-突触核蛋白与PKCα有协同作用(顶部面板). 这个底部面板显示了相应的总细胞裂解物中PKCα的免疫印迹。C类，PKCα免疫沉淀物中α-突触核蛋白的免疫印迹。车道1，用1μ米PMA 30分钟，使用抗pan-PKC抗体免疫沉淀PKCα(车道2)（该抗体识别PKCα、β和γ；Upstate Biotechnology），并用抗α-突触核蛋白SC1抗体进行免疫印迹。2号车道显示省略了抗pan-PKC抗体的免疫沉淀。3号车道(赖氨酸)显示了裂解物（30μg裂解物）的平行抗同核蛋白免疫印迹。在没有PMA刺激的情况下，未观察到反应性。天经PMA（1μ米，30分钟）*对< 0.001.E类，用PMA（1μ米，30分钟）。所有细胞系（载体、野生型α-突触核蛋白和A53Tα-突触核蛋白）经PMA处理后均表现出PKCα的稳健易位。C类，细胞质；M（M），膜。
图4。
图4。
A类脑裂解物中α-突触核蛋白和BAD的免疫共沉淀。大鼠皮层的匀浆被分离成膜和细胞质成分，并在免疫沉淀缓冲液中提取。然后免疫沉淀BAD蛋白，并用单克隆抗α-突触核蛋白免疫印迹沉淀。细胞质，C类; 膜，M（M）; 省略，Ø这是一种使用蛋白A而非1°抗体进行的免疫沉淀。B，293 HEK细胞中α-突触核蛋白与BAD的关联以及刺激PKC的药物的调节。用卡巴胆碱（1 m）处理293个HEK细胞（表达内源性α-突触核蛋白）米30分钟）或缓激肽（20 n米，30分钟）。然后用抗突触核蛋白SC1抗体从总细胞裂解物中免疫沉淀α-突触核蛋白，并用抗BAD抗体探测所得免疫印迹。Ø表示不含1°抗α-synuclein抗体的免疫沉淀。裂解产物的免疫印迹显示，每条通道中装载了等量的蛋白质（数据未显示）。C类、BAD的免疫印迹(箭头,顶部)或磷酸化-BAD136(底部,箭头指向缺失带；1:200; New England Biolabs，Beverly，MA）在从HeLa细胞裂解物中免疫沉淀FLAG标记的α-突触核蛋白后。用琼脂糖偶联的抗FLAG树脂免疫沉淀α-突触核蛋白，并用抗BAD抗体检测免疫印迹(顶部)或抗磷酸-BAD136抗体(底部). 磷酸化-BAD无特异性染色136观察到。磷酸化BAD中的条带136未转染FLAG标记的α-synuclein的对照细胞系中存在免疫印迹，因此这些条带代表非特异性结合。裂解产物的免疫印迹显示FLAG标记的野生型和A53Tα-突触核蛋白的表达相等（数据未显示）。
图5。
图5。
α-突触核蛋白与ERK级联成员的关联。左侧面板显示α-突触核蛋白免疫沉淀物与Raf-1或ERK抗体的免疫印迹。与Raf-1无关联，而与ERK有强结合。右侧面板在膜和细胞质部分显示带有Raf-1和ERK抗体的免疫印迹。在每次免疫沉淀之前，用1μ米PMA加1米米钙2+然后将匀浆分馏成膜和细胞质组分，并在免疫沉淀缓冲液中提取，如图所示分离蛋白质。细胞质，C类; 膜，M（M），并省略，Ø这是一种使用蛋白A而非1°抗体进行的免疫沉淀。
图6。
图6。
α-突触核蛋白的毒性。A类在无血清培养基中培养293 HEK细胞期间，α-突触核蛋白表达增加。这个左边显示α-突触核蛋白与SC1抗体的免疫印迹，并且正确的显示了用抗肌动蛋白抗体（Sigma）重新处理的相同免疫印迹。B，用反义α-突触核蛋白构建物转染293 HEK细胞(AS公司; 2μg）降低细胞内内源性α-突触核蛋白的表达量(左边). 控件车道(Ctrl键)显示了在相同条件下同时转染空pcDNA3质粒的细胞的裂解物。然后用抗肌动蛋白抗体重新进行免疫印迹，显示每个蛋白中装载了等量的蛋白质车道(正确的).C类，瞬时转染293 HEK(左边)或SK-N-SH细胞(中间的)通过pGL3荧光素酶质粒和载体，野生型、A53T或A30Pα-突触核蛋白构建物诱导荧光素素酶活性的剂量依赖性降低。相反，反义α-突触核蛋白转染增加了荧光素酶的表达(正确的). 对于反义实验正确的，转染细胞，然后剥夺血清24小时，然后测量荧光素酶活性。用反义α-突触核蛋白转染的细胞显示出比用载体转染的细胞更小的毒性*对< 0.05; **对<0.01；n个=每个点4。天类似实验显示，剥夺血清0、24或48小时后，台盼蓝染色显示毒性呈剂量依赖性增加。β-半乳糖苷酶载体的平行实验显示293个HEK细胞的转染率为40%。基于转染后20%的细胞对台盼蓝呈阳性，我们估计转染1μg A53Tα-synuclein可诱导293个HEK细胞约50%的细胞死亡+对< 0.05; *对< 0.01; **对< 0.001.E类，α-突触核蛋白对DNA断裂的影响。对照细胞系在基础生长条件下未观察到碎片(Vec公司,车道1)，野生型α-突触核蛋白过表达(重量,车道2)或A53Tα-突触核蛋白表达子(A53T型,车道3). 在无血清培养基中培养24小时后，对照细胞系中的寡聚DNA片段强烈(车道4)，在野生型α-突触核蛋白细胞系中为中度(车道5)，在A53Tα-突触核蛋白细胞系中缺失(车道6). 高度降解的DNA在车道6这表明坏死DNA增加。F类野生型α-synuclein增加了BAD毒性，但突变型α-sunuclein（A53T和A30P）不增加BAD毒性。293 HEK细胞与组成活性为1μg的pGL3荧光素酶质粒共转染，其中含有或不含100 ng BAD，以及含有或不含有500 ngα-突触核蛋白（野生型、A53T或A30P）。以β-半乳糖苷酶载体作为压舱物，使DNA量保持在2μg；该载体不影响荧光素酶活性*对< 0.0001;n个= 4; 比较有或没有BAD的样品。单独的A53T和A30P转染也与载体在对< 0.0001;n个= 4.
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参考文献

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