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.1999年7月；19(7):4757-65.
doi:10.1128/MCB19.7.4757。

四肽重复蛋白和耳蜗酮P58（IPK）抑制双链RNA和肿瘤坏死因子α介导的细胞凋亡

N M唐 1, M J Korth先生, 小M盖尔, M Wambach公司, S D Der公司, S K Bandyopadhyay公司, B R威廉姆斯, M G Katze女士
附属公司

四肽重复蛋白和耳蜗酮P58（IPK）抑制双链RNA和肿瘤坏死因子α介导的细胞凋亡

N M唐等。 分子细胞生物学. 1999年7月.

摘要

P58（IPK）是一种含有四三肽重复序列的耳蜗酮，参与应激激活的细胞途径，并抑制蛋白激酶PKR的活性，PKR是干扰素抗病毒和抗增殖特性的主要介质。为了更好地了解P58（IPK）的分子作用，我们构建了NIH 3T3细胞系，表达野生型P58（IPK）或P58（IP K）缺失突变体DeltaTPR6，该突变体不与PKR结合或抑制PKR。当用双链RNA（dsRNA）处理时，表达DeltaTPR6的细胞在真核启动因子2alpha磷酸化和NF-kappaB活化方面表现出显著增加，表明存在功能性PKR。相反，这两种PKR依赖性事件都被野生型P58（IPK）的过度表达所阻断。此外，P58（IPK）细胞系，而非DeltaTPR6细胞系，对dsRNA诱导的凋亡具有抵抗力。总之，这些发现表明，P58（IPK）通过抑制多种PKR依赖功能来调节dsRNA信号通路。相反，P58（IPK）和DeltaTPR6细胞系都对肿瘤坏死因子α诱导的细胞凋亡具有抵抗力，这表明P58（IPK）可能是一种更通用的程序性细胞死亡抑制剂，独立于其PKR抑制特性。根据这一假设，尽管PKR在表达DeltaTPR6的细胞中保持活性，但DeltaTPR 6细胞系表现出转化的表型，并且在裸鼠中具有致瘤性。因此，P58（IPK）的抗凋亡功能可能是其恶性转化细胞能力的一个重要因素。

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图1
图1
牛P58IPK公司或ΔTPR6在稳定转染的NIH 3T3细胞系中有效产生。P58的免疫印迹分析IPK公司进行ΔTPR6蛋白生成。野生型P58蛋白提取物（100μg）IPK公司（第58页IPK公司-1和P58IPK公司-2） 用识别牛P58的多克隆抗体分析了ΔTPR6（ΔTPR 6-1和ΔTPR-6-2）细胞系IPK公司（通道1，Madin-Darby牛肾细胞），但不是内源性P58IPK公司存在于小鼠细胞中的蛋白质（第2通道，NEO）。由于ΔTPR6中的缺失很小，ΔTPR 6蛋白迁移到与P58大致相同的位置IPK公司在所示的12%丙烯酰胺凝胶中。因此，使用梯度凝胶（10-20%丙烯酰胺）来区分58-kDa野生型P58IPK公司和54-kDaΔTPR6蛋白（未显示）。
图2
图2
PKR磷酸化ΔTPR6表达细胞中的eIF-2α。对培养细胞系中eIF-2α磷酸化的稳态水平进行了分析。P58提取物IPK公司-1、ΔTPR6-1或中对数期NEO细胞，每种提取物20μg进行垂直等电聚焦。将解析的蛋白质转移到硝化纤维素膜上，并用eIF-2α单克隆抗体对印迹进行检测。通过扫描激光密度计测定每个泳道中磷酸化和非磷酸化eIF-2α的比率。poly（I·C）处理后比率的变化表明PKR活性。P58中磷酸化与非磷酸化eIF-2α的比率增加了1.3倍IPK公司细胞系和ΔTPR6和NEO细胞系的4.5倍。eIF-2α的磷酸化（P）和非磷酸化形式用箭头表示。
图3
图3
第58页IPK公司而不是ΔTPR6，抑制dsRNA诱导的NF-κB活化。NEO中NF-κB DNA结合活性，P58IPK公司-图中显示了1和ΔTPR6-1细胞系。用单独培养基、含有聚（I·C）（100μg/ml）或含有TNF-α（10 ng/ml）的培养基处理细胞。在EMSA中使用32P标记的PRDII寡核苷酸探针。NF-κB–PRDII复合物如箭头所示。
图4
图4
第58页IPK公司而不是ΔTPR6介导对dsRNA诱导的凋亡的抵抗。dsRNA诱导NEO、ΔTPR6-1和P58细胞凋亡的分析IPK公司-1个细胞系。用聚（I·C）（1、10或100μg/ml）处理细胞16 h。用荧光素dUTP和脱氧核苷酸转移酶标记DNA链断裂，检测凋亡诱导的DNA片段。如材料和方法所述，通过流式细胞术定量凋亡细胞的百分比。
图5
图5
第58页IPK公司ΔTPR6介导对TNF-α诱导的凋亡的抵抗。NEO、ΔTPR6-1和P58IPK公司-用TNF-α处理1个细胞系16 h，并按照材料和方法中的描述检查细胞活力和凋亡诱导的DNA片段。（A） TNF-α处理后16 h细胞单层的形态学特征。（B） 对TNF-α处理细胞制备的DNA进行电泳分析。
图6
图6
ΔTPR6表达细胞表现出转化的表型。近地天体的形态和生长特征，P58IPK公司-图中显示了1和ΔTPR6-1细胞系。细胞系在2×10的条件下培养4含有10%FBS和400μg/ml G418的DMEM中每100-mm直径培养皿中的细胞。（A到C）中期对数期细胞的形态特征。与NEO细胞相比，P58IPK公司和ΔTPR6细胞株表现出纺锤状形态，且折射率增加。（D至F）细胞汇合后4天保持在培养基中，显示P58上的转化灶IPK公司和ΔTPR6细胞单层。（G至I）在软琼脂中生长。P58中观察到锚定非依赖性生长IPK公司和ΔTPR6细胞系。放大倍数，×100。
图7
图7
牛P58IPK公司或ΔTPR6在肿瘤和肿瘤细胞系中产生。P58的免疫印迹分析IPK公司进行ΔTPR6蛋白生成。（左）注射了ΔTPR6细胞系的小鼠的四个肿瘤（两个肿瘤来自注射了△TPR6-1表达细胞的小鼠，分别命名为ΔTPR-6-1.1和ΔTPR 6-1.2，两个肿瘤来源于注射了△TPR6-2表达细胞，分别命名是ΔTPR1-2.1和Δ的TPR6-2.2），一个肿瘤来自于注射了P58的小鼠IPK公司-1细胞系（P58IPK公司-1） 使用抗P58抗体进行分析IPK公司单克隆抗体2F8（5）。（右）来自表达ΔTPR6和P58的细胞系IPK公司-用P58免疫印迹法分析过表达肿瘤IPK公司多克隆抗体。在每个小组中，用MDBK细胞制备的细胞提取物作为牛P58的来源IPK公司蛋白质作为阳性对照（1号通道）。将从NEO细胞系制备的细胞提取物作为阴性对照品进行平行分析（第2道）。
图8
图8
P58型号IPK公司抑制细胞凋亡。PKR被认为是dsRNA诱导的凋亡途径的重要组成部分，并且通过P58的过度表达抑制PKRIPK公司导致对dsRNA诱导的凋亡产生抵抗。与ΔTPR6不能抑制PKR依赖性功能一致，表达ΔTPR6的细胞在dsRNA处理后发生凋亡。相比之下，P58IPK公司和ΔTPR6细胞株对TNF-α诱导的凋亡具有抵抗力。我们建议第58页IPK公司（和ΔTPR6）也可以以PKR非依赖性方式调节TNF-α途径。这种调节很可能发生在PKR上游的通路中的一个点上。抑制细胞凋亡可能是P58过度表达的主要机制IPK公司诱发恶性转化。有关其他详细信息，请参阅讨论。
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