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.1998年6月29日；141(7):1625-36.
doi:10.1083/jcb.141.7.1625。

神经母细胞瘤N1E-115细胞中Rho相关蛋白激酶（p160ROCK）调节的轴突重塑的分子解剖

M Hirose先生 1, T石崎, N渡边岛, 姆尤哈塔, O克拉嫩堡, W H穆勒纳, F松村, M前川, H比托, S Narumiya公司
附属公司

神经母细胞瘤N1E-115细胞中Rho相关蛋白激酶（p160ROCK）调节的轴突重塑的分子解剖

M Hirose先生等。 J细胞生物学. .

摘要

在神经母细胞瘤N1E-115细胞中检测到小GTPase Rho及其靶点之一p160ROCK（一种Rho相关卷曲形成蛋白激酶）在神经突起重塑中的关键作用。使用野生型和主要阴性形式的p160ROCK和p160ROCK特异性抑制剂Y-27632，我们在这里表明，p160 ROCK激活对于激动剂诱导的轴突收缩和细胞圆形是必要的和充分的。轴突回缩伴随着肌球蛋白轻链磷酸化的升高以及中间丝和微管的解体。Y-27632以类似的浓度依赖性方式阻断了轴突收缩和肌球蛋白轻链磷酸化的升高。另一方面，通过p160ROCK的显性负性表达抑制p160ROCK活性，通过诱导中间丝和微管的重组，在血清中诱导神经突起。p160ROCK抑制产生的轴突外生长被Cdc42和Rac的显性负性形式的共同表达所阻断，表明p160ROCK通过抑制Cdc42与Rac的激活而组成性地和负性地至少部分地调节轴突的形成。在瑞士3T3细胞中也观察到Rho-ROCK通路抑制剂组装微管和中间丝形成延伸过程。这些结果表明，Rho/ROCK依赖性强直抑制细胞进程的延伸是通过激活基于actomysin的收缩性，以及抑制许多细胞类型（包括但不限于神经细胞）中中间丝和微管的组装来实现的。

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图1
图1
p160ROCK的野生型和KD-IA突变体的示意图。p160ROCK的结构域和KD-IA突变体中的点突变如图所示。杜兰特，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域；CCD（电荷耦合器件），卷曲-线圈形成两族α-螺旋结构域；RBD公司，Rho结合域；酸碱度，pleckstrin同源结构域；客户需求日，富含半胱氨酸的锌指结构域；十、 氨基酸数目突变的位置。
图2
图2
N1E-115细胞p160ROCK蛋白的免疫印迹(A类)Y-27632抑制LPA诱导的神经突起收缩和细胞圆形(B–E类). (A类)在Laemmli–SDS-PAGE样品缓冲液中裂解N1E-115细胞，然后使用抗p160ROCK抗体进行免疫印迹。(B–E类)，N1E-115细胞在无血清二甲醚中维持24小时，并允许神经突起延伸。对细胞进行预处理(B类和C类)或使用10μM Y-27632(D类和E类)30分钟，暴露于1μM LPA中10分钟。在药物添加前拍摄相同的视野(B类和D类)LPA刺激后(C类和E类). 棒材，100μm。
图3
图3
Y-27632对LPA诱导的N1E-115细胞轴突收缩的浓度依赖性抑制。用指示浓度的Y-27632预处理血清饥饿的N1E-115细胞30分钟，然后暴露于1μM LPA中10分钟。显示了神经突起完全回缩的细胞百分比。三个实验的结果显示为平均值±SEM。
图4
图4
表达活性Rho和p160ROCK的N1E-115细胞的形态。用V14Rho转染N1E-115细胞(A类和B类)或野生型p160ROCK(C类和D类)、和在无血清DME中培养12小时。通过阳性Myc-染色鉴定过度表达细胞(A类和C类)并检测了它们的F-actin结构(B类和D类). 请注意，即使在缺乏血清的条件下，转染细胞也不会延伸轴突。此外，在一些p160ROCK表达细胞中也观察到明显的气泡形成。棒材，20μm。
图5
图5
表达KD-IA突变体的N1E-115细胞和用Y-27632处理的N1E-115细胞的形态学。(A类)用p160ROCK的显性阴性形式KD-IA突变体转染N1E-115细胞，并在10%FBS存在下培养16h(一)和F-肌动蛋白(b条). 注意，转染细胞在有血清存在的情况下延伸出长的神经突。(B类)N1E-115细胞在10%FBS存在下培养，并用10μM Y-27632（一种特殊的ROCK抑制剂）处理。在0时拍摄相控显微照片(一)和60分钟(b条)添加化合物后。棒材，20μm。
图6
图6
N17Cdc42和N17Rac对p160ROCK的KD-IA突变诱导的轴突生成的抑制作用。仅用KD-IA p160ROCK转染N1E-115细胞(A类和B类)，带有N17Cdc42和KD-IA p160ROCK(C类和D类)或使用N17Rac和KD-IA p160ROCK(E类和F类). 转染细胞在含有10%FBS的DME中培养16 h。p160ROCK染色鉴定过度表达细胞(A类,C类、和E类)F-actin用阴茎倍体蛋白染色(B类,D类、和F类). 棒材，20μm。(G公司)无轴突、短轴突和长轴突细胞的定量。如上所述，确定了仅表达KD-IA、KD-IA和N17Cdc42或KD-IA与N17Rac的N1E细胞，并确定了不含轴突或轴突短于或长于100μm的细胞数量。*，P（P）与KD-IA相比<0.001。
图6
图6
N17Cdc42和N17Rac对p160ROCK的KD-IA突变诱导的轴突生成的抑制作用。仅用KD-IA p160ROCK转染N1E-115细胞(A类和B类)，带有N17Cdc42和KD-IA p160ROCK(C类和D类)或使用N17Rac和KD-IA p160ROCK(E类和F类). 转染细胞在含有10%FBS的DME中培养16 h。p160ROCK染色鉴定过度表达细胞(A类,C类、和E类)F-actin用阴茎倍体蛋白染色(B类,D类、和F类). 棒材，20μm。(G公司)无轴突、短轴突和长轴突细胞的定量。如上所述，确定了仅表达KD-IA、KD-IA和N17Cdc42或KD-IA与N17Rac的N1E细胞，并确定了不含轴突或轴突短于或长于100μm的细胞数量。*，P（P）与KD-IA相比<0.001。
图7
图7
LPA诱导N1E-115细胞MLC磷酸化及其被Y-27632抑制。(A类)LPA诱导MLC磷酸化的时间进程。血清培养N1E-115细胞与1μM LPA孵育指定时间。在Laemmli-SDS-PAGE样品缓冲液中收集细胞，然后使用抗磷酸MLC抗体进行免疫印迹。(B类)Y-27632对MLC磷酸化的浓度依赖性抑制。用指示浓度的Y-27632处理血清饥饿的N1E-115细胞30分钟，然后用LPA刺激2分钟。如上所述对细胞进行裂解和分析。在LPA刺激或Y-27632处理期间，细胞中MLC的含量没有改变。
图8
图8
血清饥饿、血清喂养和KD-IA转染的N1E-115细胞的外周蛋白和微管蛋白染色。N1E-115细胞在无培养基中培养(A类和D类)或存在(B类和E类)或转染p160ROCK的KD-IA突变体，并在含有10%血清的DME中培养(C类和F类). 细胞被抗外周蛋白染色(A类,B类、和C类)或抗管蛋白(D类,E类、和F类)抗体。在C类和F类，细胞也被抗myc抗体染色(C类)，或抗ROCK抗体(F类)，并鉴定表达KD-IA蛋白的细胞（箭头所示）。显示了由共焦成像系统从光学部分构建的图像。棒材，20μm。
图10
图10
瑞士3T3细胞的波形蛋白染色。瑞士3T3细胞在有人在场的情况下培养(A类和B类)或缺席(C类和D类)或用30μg/ml C3外酶处理72小时(E类和F类)或10μM Y-27632 2小时(G公司和H（H）)在有血清的情况下，用OregonGreen阴茎倍体蛋白染色(A类,C类,E类、和G公司)或抗波形蛋白抗体(B类,D类,F类、和H（H）). 显示了由共焦成像系统从光学部分生成的图像。棒材，20μm。
图11
图11
瑞士3T3细胞的微管蛋白染色。瑞士3T3细胞在有人在场的情况下培养(A类和B类)或缺席(C类和D类)血清或C3外酶(E类和F类)或Y-27632(G公司和H（H）)在有血清的情况下，用OregonGreen阴茎倍体蛋白染色(A类,C类,E类、和G公司)或抗微管蛋白抗体(B类,D类,F类、和H（H）). 显示了由共焦成像系统从光学部分构建的图像。棒材，20μm。
图9
图9
显微注射C3外酶的瑞士3T3成纤维细胞的视频显微镜检查。将瑞士细胞保存在含有10%FBS的Hepes缓冲DME中的玻璃盖玻片上，并用C3外酶微量注射。通过延时视频显微镜监测注入细胞的形态。每两分钟拍摄四张图像。注射后的时间显示在每个图像的左上角。注意细胞过程的形态以时间依赖的方式发生变化；箭头，一个过程的时间依赖性延伸。棒材，20μm。
图12
图12
神经突起重塑中Rho–ROCK通路的信号转导和交叉对话模型。p160ROCK在Rho下游被激活以响应激动剂刺激，进而诱导基于肌动球蛋白的收缩性和微管和中间丝的分解，导致轴突收缩。p160ROCK还向Cdc42/Rac通路传递负信号，并通过张力抑制其活动来抑制神经突起的生长。cAMP–A激酶途径的激活可能会抑制Rho–ROCK途径并释放对神经突起生长的抑制。如GFAP（Kosako等人，1997）所示，中间丝的分解可能是由p160ROCK在该细胞骨架蛋白的特定氨基酸残基上的直接磷酸化引起的，也可能是ROCK对肌动球蛋白系统影响的次要结果。
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