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.2023年9月1日；64（12）：1。
doi:10.1167/iovs.64.12.1。

急性眼压下角蛋白8缺乏加重视网膜神经节细胞损伤

张成寿 1, 于乃吉（Naiji Yu） 1, 齐玉琴 1, 吴兴迪 1, 顾玉祥 2, 刘彤（音译） 1, 张琪（音译） 1, 刘欣（Xin Liu） 1, 陈敏（音） 1, 王凯军 1
附属公司

急性眼压下角蛋白8缺乏加重视网膜神经节细胞损伤

张成寿等。 投资眼科视觉科学. .

摘要

目的：角蛋白8/18（KRT8/18）是中间丝家族的成对成员，在调节生理活动方面发挥着重要作用，而不仅仅是支持细胞和细胞器的机械强度。然而，KRT8/18在视网膜神经节细胞（RGC）中的存在以及在急性高眼压（AOH）小鼠模型中的神经保护功能尚不清楚，值得探索。

方法：我们确定了KRT8/18在正常人和小鼠视网膜以及原发性视网膜神经节中的存在。AOH建模后检测KRT8/18水平。腺相关病毒（AAV）系统被玻璃体内用于选择性敲除RGC中的KRT8。检测视网膜组织学改变、RGC丢失和功能障碍以及胶质增生。研究细胞凋亡标志物和MAPK通路。

结果：KRT8/18存在于视网膜各层，在视网膜干细胞中高度表达，在AOH诱导后增加。RGC中的KRT8基因敲除在未建立AOH模型的情况下未导致视网膜组织病理学改变和RGC丢失。然而，在KRT8缺乏后，AOH显著促进了整个视网膜和视网膜内部厚度的损失，RGC的减少、凋亡和功能障碍，以及胶质细胞的激活。此外，在伴有KRT8基因敲除的AOH视网膜中发现下调的Bcl-2和上调的cleaved-Caspase 3，这可能是由MAPK通路（JNK、p38和ERK）磷酸化水平升高引起的。

结论：KRT8缺乏通过AOH视网膜MAPK通路的异常激活促进RGC凋亡和神经变性。靶向KRT8可能是一种新的治疗方法，可将RCG从青光眼损伤中拯救出来。

PubMed免责声明

利益冲突声明

披露：C.张，无；N.余，无；Q.秦，无；十、吴，无；Y.Gu先生，无；T.刘，无；Q.张，无；十、刘，无；陈先生，无；K·王，无

数字

图1。
图1。
KRT8/18在正常视网膜和AOH视网膜中的表达。(一个)和(C类)用DAPI标记的正常人和小鼠视网膜（标尺=50µm）和初级视网膜神经节细胞（标尺=10µm(蓝色)，Tuj-1(绿色)和KRT8/18(红色). (B类)正常人和小鼠视网膜中KRT8/18的代表性免疫组织化学图像（比例尺=50µm）。(D类)AOH治疗后不同时间视网膜中KRT8/18蛋白的Western blot条带。(E类， F类)KRT8蛋白水平的定量分析(n个=6）和KRT18(n个=6），归一化为GADPH。数据表示为平均值±SD，并使用ANOVA进行分析；*P（P）< 0.05,***P（P）与对照组相比<0.01。
图2。
图2。
AAV介导的视网膜KRT8水平降低。(一个)和(我)AAV注射后视网膜中KRT8、KRT18、裂解天冬氨酸酶3和Bcl-2的蛋白印迹带。(B类， C类)和(M（M）， N个)定量分析KRT8、KRT18、裂解天冬氨酸酶3和Bcl-2的蛋白质水平，并将其归一化为GADPH(n个=6或8）。(D类)用DAPI标记AAV注射后视网膜的典型免疫荧光图像(蓝色)，Tuj-1(绿色)和KRT8/18(红色). 比例尺=50µm。(E类)AAV注射后视网膜的典型H&E染色图像。比例尺=100µm。(F类， G公司)通过H&E染色图像定量分析注射AAV后整个视网膜和视网膜亚层的厚度(n个= 3). (H（H）)视网膜平板中央区和周边区Brn3a阳性RGC计数的定量分析(n个= 4). (我)注射AAV后，用Brn3a（红色）标记的视网膜扁平支架的代表性免疫荧光图像。比例尺=100µm。(J型)通过TEM观察AAV注射后视网膜RGC的超微结构（n=细胞核；m=线粒体；和红色正方形=每个插图的面积）。比例尺=5µm。(K)AAV注射后视网膜的代表性TUNEL染色图像。数据表示为平均值±SD，并使用Student’st吨-测试；纳秒P（P）> 0.05,****P（P）与shCtrl组相比<0.0001。
图3。
图3。
角蛋白8敲除对AOH视网膜RGC造成更严重的损伤。(一个)AAV玻璃体内注射、AOH诱导和后续实验的时间表和治疗示意图。注：一些使用的图形材料来自Figdraw网站。(B类)AOH后不同组视网膜的代表性H&E染色图像。比例尺=100µm。(C类， D类)通过H&E染色图像定量分析注射AAV后整个视网膜和视网膜亚层的厚度(n个= 3). (E类)用于RGC计数的视网膜扁平支架的中间和顶部区域示意图。(F类)视网膜平板中央区和周边区Brn3a阳性RGC计数的定量分析(n个= 4). (G公司)AOH后不同组视网膜扁平支架的代表性免疫荧光图像，用Brn3a标记(红色). 比例尺=100µm。(H（H）)AOH后不同组RGC胞体和轴突的超微结构变化。N=核；m=线粒体；红箭=线粒体肿胀或破裂；双红色箭头=脱髓鞘；红色正方形=每个插图的面积。比例尺=5µm或2µm。(我)AOH后不同组视网膜PhNR的代表性曲线。五角星和虚线标记了PhNR基线和峰值之间的面积。(J型)AOH后不同组PhNR振幅的定量分析(n个= 5). 数据表示为平均值±SD，并使用ANOVA进行分析；*P（P）< 0.05,**P（P）< 0.001,***P（P）< 0.001,****P（P）与对照组相比<0.0001；#P（P）< 0.05,##P（P）< 0.01,####P（P）<0.0001与shCtrl+AOH组相比。
图4。
图4。
角蛋白8敲除促进AOH诱导后RGC凋亡和胶质细胞活化。(一个)AOH后不同组具有代表性的TUNEL染色图像。白色箭头=GCL中TUNEL染色阳性的细胞；和白色正方形=INL中TUNEL染色阳性的细胞。(B类)TUNEL染色阳性细胞数的定量分析(n个= 6). (C类， D类)和(K)AOH后不同组视网膜的KRT8、KRT18、Tuj-1、裂解的Caspase 3、Bcl-2、Vimentin和Iba-1的蛋白质印迹带。(E-I公司)和(我， M（M）)定量分析KRT8、KRT18、Tuj-1、裂解天冬氨酸酶3、Bcl-2、波形蛋白和Iba-1的蛋白质水平，并将其归一化为GADPH(n个=4或6）。(J型)和(N个)用DAPI标记的视网膜典型免疫荧光图像(蓝色)图1(绿色)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3或波形蛋白（红色）。白色箭头=Tuj-1和Caspase 3染色的典型RGC。比例尺=50µm。数据表示为平均值±SD，并使用ANOVA进行分析；纳秒P（P）> 0.05;*P（P）< 0.05,***P（P）< 0.001,****P（P）与对照组相比<0.0001；#P（P）< 0.01,##P（P）< 0.01,####P（P）<0.0001与shCtrl+AOH组相比。
图5。
图5。
角蛋白8敲除促进AOH诱导后MAPK通路的激活。(一个)AOH后不同组视网膜p-JNK、JNK，p-p38、p38、p-ERK、ERK和c-Jun蛋白印迹带。(B-E公司)定量分析p-JNK、p38、p-ERK和c-Jun的蛋白质水平，并将其归一化为非磷酸化蛋白质或GADPH(n个= 4). (F类)用DAPI标记的视网膜典型免疫荧光图像(蓝色)，Tuj-1(绿色)和p-JNK(红色).白色箭头=Tuj-1和p-JNK染色的典型RGC。比例尺=50µm。(G公司)AOH下KRT8在RGC凋亡中的机制示意图。这个红色箭头代表KRT8击倒条件下的最终变化。数据以平均值±标准差表示，并使用方差分析进行分析；*P（P）< 0.05,**P（P）< 0.01,***P（P）< 0.001,****P（P）与对照组相比<0.0001；##P（P）< 0.01,####P（P）<0.0001与shCtrl+AOH组相比。
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