Discovery of a lectin domain that regulates enzyme activity in mouse N-acetylglucosaminyltransferase-IVa (MGAT4A)

doi:10.1038/s42003-022-03661-w

。2022年7月19日；5(1):695.

doi:10.1038/s42003-022-03661-w。

在小鼠N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-IVa（MGAT4A）中发现调节酶活性的凝集素结构域

附属公司

¹日本大阪大学微生物疾病研究所分子免疫学系。mnagae@biken.osaka-u.ac.jp。
²日本大阪大学免疫学前沿研究中心分子免疫学实验室。mnagae@biken.osaka-u.ac.jp。
^三日本岐阜大学糖核研究所（iGCORE）。
⁴细胞和分子生物技术研究所，国家先进工业科学技术研究所（AIST），日本茨城筑波。
⁵美国密西西比州密西西比大学生物分子科学系糖学卓越研究中心。
⁶日本宫城县仙台市东北医科大学分子生物膜和糖生物学研究所结构糖生物学分部。
⁷日本岐阜岐阜大学自然科学技术研究生院。
⁸日本东京大学药学系。
⁹日本岐阜大学糖核研究所（iGCORE）。kizuka@gifu-u.ac.jp。

PMID： 35854001
预防性维修识别码： PMC9296478
内政部： 10.1038/s42003-022-03661-w

在小鼠N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-IVa（MGAT4A）中发现调节酶活性的凝集素结构域

Masamichi Nagae公司等。公共生物。 2022。

。2022年7月19日；5(1):695.

doi:10.1038/s42003-022-03661-w。

附属公司

¹日本大阪大学微生物疾病研究所分子免疫学系。mnagae@biken.osaka-u.ac.jp。
²日本大阪大学免疫学前沿研究中心分子免疫学实验室。mnagae@biken.osaka-u.ac.jp。
^三日本岐阜岐阜大学糖核研究所。
⁴细胞和分子生物技术研究所，国家先进工业科学技术研究所（AIST），日本茨城筑波。
⁵美国密西西比州密西西比大学生物分子科学系糖学卓越研究中心。
⁶日本宫城县仙台市东北医科大学分子生物膜和糖生物学研究所结构糖生物学分部。
⁷岐阜大学自然科学与技术研究生院，岐阜，日本。
⁸日本东京大学药学系。
⁹日本岐阜大学糖核研究所（iGCORE）。kizuka@gifu-u.ac.jp。

PMID： 35854001
预防性维修识别码： PMC9296478
内政部： 10.1038/s42003-022-03661-w

摘要

N-糖基化是一种常见的翻译后修饰，N-聚糖中GlcNAc分支的数量影响糖蛋白功能。N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-IVa（GnT-IVa，也称为MGAT4A）在N-聚糖的α1-3甘露糖臂上形成β1-4 GlcNAc分支。GnT-IVa的下调或丢失通过胰腺β细胞中葡萄糖转运蛋白-2的失调导致糖尿病表型。尽管GnT-IVa具有生理重要性，但其结构和催化机制尚不清楚。在这里，我们鉴定了小鼠GnT-IVa的C末端区域中的凝集素结构域。凝集素结构域的晶体结构与细菌GlcNAc-结合凝集素的结构相似。使用157个聚糖和溶液核磁共振进行的综合聚糖结合分析表明，GnT-IVa凝集素结构域与具有β1-4 GlcNAc分支的产物N-聚糖选择性相互作用。糖识别关键残基的点突变会削弱酶的活性，这表明凝集素结构域是高效催化反应的调节亚基。我们的发现为N-聚糖分支结构的生物合成提供了见解。

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数字

**图1。GnT IVa C末端区域凝集素结构域的存在。**
一GnT IV家族成员催化的GlcNAc转移反应的示意图。GnT-IVc在哺乳动物中的活性尚未得到证实。b条与小鼠GnT-IVa的中心区域和C末端区域同源的蛋白质。显示了PDB ID和GnT-IVa的序列标识。**c（c）**NagH与GlcNAcβ1-2Man复合物中碳水化合物结合模块的总体结构（PDB代码：2WDB）（左）和糖结合位点的特写视图（右）。d日GnT-IVa中的保守氨基酸残基在与GlcNAcβ1-2Man复合物中NagH碳水化合物结合模块的表面以红色突出显示。**e（电子）**本研究中使用的小鼠GnT-IVa的构建物。**（f）**从COS7培养基中纯化可溶性GnT-IVa酶及其缺失突变体。通过SDS-PAGE和随后的银染色检查蛋白质的纯度（左）。蛋白质的酶活性通过与PA标记的受体糖孵育来测量，并通过HPLC进行分析（右上图）。蛋白质相对于#1的比活性如图所示(n个 = 3）（右下）。图表显示平均值±SD。

**图2。GnT-IVa凝集素结构域的聚糖结合活性。**
一GST GnT IVa凝集素结构域（#5）从*大肠杆菌*，GST标签被切割并消除。通过SDS-PAGE和随后的CBB染色检查纯度（左）。净化步骤中凝胶过滤分析的洗脱曲线如图所示（右）。在存在2 mM Glc（绿色）或GlcNAc（红色）的情况下进行相同的凝胶过滤分析。b条溶液核磁共振分析之间的相互作用¹⁵N标记的GnT-IVa凝集素结构域和GlcNAc单糖。覆盖¹H（H）-¹⁵0.4 mM的N HSQC光谱[¹⁵N] GlcNAc的GnT-IVa凝集素结构域的蛋白-配体比为1:0、1:1、1:2、1:3、1:5和1:7。峰A用于计算离解常数。**c（c）**溶液核磁共振分析之间的相互作用¹⁵N-标记的GnT-IVa凝集素结构域和GlcNAcβ1-2Man二糖。覆盖¹H（H）-¹⁵0.4 mM的N HSQC光谱[¹⁵N] GlcNAcβ1-2Man的GnT-IVa凝集素结构域的蛋白配体比为1:0、1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5和1:3。d日的绘图¹GlcNAc（填充正方形）和GlcNAcβ1-2Man（填充圆形）的H化学位移（峰值A）与配体-蛋白质摩尔比。**e（电子）**额叶亲和色谱中157个聚糖与固定化GnT-IVa凝集素结构域的结合强度。

**图3。GnT-IVa凝集素结构域的结构分析。**
一GnT-IVa凝集素结构域及其D445A突变体的纯度*大肠杆菌*通过SDS-PAGE和随后的CBB染色进行检查。b条显示了净化步骤中凝胶过滤分析的洗脱曲线。蛋白质吸光度（A₂₈₀)离子电导分别为蓝色和红色。离子电导的峰值表示单柱体积的点。**c（c）**小鼠GnT-IVa D445A凝集素结构域的整体结构。d日DALI定义的GnT-IVa凝集素结构域的结构邻域。NagH（PDB编码：2W1U，左面板）和IFT25（PDB代码：2YC4，右面板）的总体结构，它们在结构上与GnT-IVa凝集素结构域相似。这两种蛋白质的视角与**c（c）**碳水化合物和钙离子分别显示在棒状和球形模型中。**e（电子）**GnT-IVa（蓝色，左面板）和NagH CBM32与GlcNAcβ1-3GalNAc（PDB代码：2W1U，灰色，中面板）和IFT25（PDB编码：2YC4，右面板）复合物中推测糖结合位点的特写图。木棍模型中显示了四种相应的残留物并进行了标记。

**图4。计算了聚糖与GnT-IVa凝集素结构域的结合能和结合模式。**
一,b条糖链#108在500 ns分子动力学后的结合模式一β1-2GlcNAc···D445或b条β1-4GlcNAc·∙∙D445结合模式。为了清晰起见，聚糖碳的颜色不同：α1-3臂（C青色）、α1-6臂（C黄色）、二分GlcNAc（C粉红色）和壳二糖核（C紫色）。红色虚线显示6℃范围内聚糖#108和氨基酸残基之间的极性相互作用。**c（c）**受体底物双纳米聚糖（#103）和产物聚糖（#105、#107和#108）在两种不同的结合模式下的MM/GBSA能量，其中α1-3臂的不同取代基在结合位点与D445相互作用：（i）β1-2GlcNAc（蓝条）或（ii）β1-4GlcNAc（橙条）。该图显示了自由能的平均值±标准偏差（500帧）。

**图5。GnT-IVa介导的糖基化对凝集素结构域的需求。**
一可溶性GnT-IVa酶及其D445A突变体的构建物。b条通过SDS-PAGE和随后的凝胶蓝染色检查从COS7培养基制备的酶的纯度。**c（c）**蛋白质的酶活性通过与PA标记的受体糖孵育来测量，并通过HPLC进行分析（左）。蛋白质的特定活性如下所示(n个 = 3）（右）。图表显示平均值±SD(*第页 < 0.05，Mann-Whitney U检验）。d日使用不同浓度的供体底物（左）和受体底物（右）对WT GnT-IVa和D445A突变体进行动力学分析。**e（电子）**来自模拟处理的HEK293野生型和*MGAT4A型*/*MGAT4B型*用空载体（mock）、WT GnT-IVa-myc载体或GnT-IVa D445A-myc载体转染的双敲除（DKO）HEK293细胞进行SDS-PAGE，并用HRP-结合DSA（左）、抗myc抗体（右上）或抗GAPDH抗体（右下）进行印迹。

**图6。GnT-IVa凝集素结构域作用的示意图模型。**
我们的数据显示凝集素结构域特异性结合N个-聚糖产物，是高效GnT-IVa反应所必需的。我们认为凝集素结构域参与(一)催化反应循环中产品的迅速释放或(b条)β1-4GlcNAc已经存在的糖蛋白的有效修饰。

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