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.2021年6月22日；118（25）：e210770118。
doi:10.1073/pnas.2107770118。

LAP2β表达增加可消除核层粘连缺陷神经元和成纤维细胞的核膜破裂

Natalie Y Chen（娜塔莉·Y·陈） 1, 保罗·H·金 1, 土一平 1, 叶阳 1, 帕特里克·J·海泽 1, 史蒂芬·G·杨 2 三 4, 洛伦·芳格（Loren G Fong） 2
附属公司

LAP2β表达增加可消除核层粘连缺陷神经元和成纤维细胞的核膜破裂

Natalie Y Chen（娜塔莉·Y·陈）等。 美国国家科学院程序. .

摘要

核层粘连的缺陷或不足会导致许多细胞类型的病理改变，最近的研究表明，核膜破裂是细胞毒性的一个原因。我们之前在缺乏层粘连蛋白B1的小鼠胚胎发育中观察到NM破裂和进行性细胞死亡。我们还观察到核层粘连缺陷成纤维细胞中NM频繁破裂和DNA损伤。调节NM破裂敏感性的因素尚不清楚，但我们注意到，在NM破裂的成纤维细胞中，LAP2β（一种染色质结合的内NM蛋白）水平较低。在这里，我们探讨了核层粘连缺陷神经元和成纤维细胞中LAP2β和NM破裂之间的明显联系，并测试了控制LAP2α表达水平是否会改变NM破裂频率。在层粘连蛋白B1缺陷胚胎的皮质板神经元中，我们观察到低LAP2β水平与NM破裂之间存在强烈的相关性。我们还发现培养的神经元中LAP2β水平较低，NM频繁断裂最小1-/-神经球。减少LAP2β的表达最小1-/-带有siRNA的神经元显著增加NM破裂频率（不影响NM破裂持续时间），而LAP2β表达增加则消除NM破裂并减少DNA损伤。在核层粘连缺陷成纤维细胞中观察到一致的结果。LAP2β表达的减少增加了NM破裂，而LAP2β表达的增加实际上消除了NM破裂。LAP2β表达增加几乎消除了受到机械应力的细胞中NM破裂（这种干预增加了NM破裂）。我们的研究表明，增加LAP2β的表达可以增强核层粘连缺陷细胞中NM的完整性，并显著降低NM破裂的频率。

关键词：膜相关多肽2；核膜；核层粘连蛋白；核膜破裂。

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利益冲突声明

作者声明没有竞争性利益。

数字

图1。
图1。
前脑特异性失活最小1导致神经细胞密度降低，LAP2β表达降低，NM破裂。(A类和B类)E18.5大脑皮层的荧光显微镜图像最小1飞行/飞行ROSA公司nT-nG（纳克）(A类)和Emx1-核心Lmnb1飞行/飞行ROSA公司nT-nG（纳克）(B类)小鼠胚胎。ROSA公司nT nG在缺乏外源基因的情况下，转基因产生一个核靶向td番茄报告子Cre公司和核靶向GFPCre公司.td番茄为红色；GFP为绿色。切片用抗内核膜蛋白LAP2β（白色）和GFP（绿色）抗体染色。（比例尺，50μm）(C类和D类)E18.5中皮层板（CP）神经元和心室区（VZ）细胞的高倍图像最小1飞行/飞行ROSA公司nT-nG（纳克）(C类)和Emx1-核心Lmnb1飞行/飞行ROSA公司nT-nG（纳克）(D类)小鼠胚胎。DNA用DAPI（蓝色）染色。黄色箭头表示大脑中CP神经元NM破裂Emx1-核心Lmnb1飞行/飞行ROSA公司nT-nG（纳克）胚胎。NM破裂的CP神经元表现出LAP2β水平降低，且沿着核边缘分布不均匀。LAP2β在VZ细胞中分布正常Emx1-核心Lmnb1飞行/飞行ROSA公司nT nG而荧光报告子主要局限于细胞核。VZ包含分裂细胞；因此，在一些细胞的细胞质中检测到低水平的GFP。（比例尺，10μm）(E类)E18.5大脑皮层的免疫荧光显微镜最小1飞行/飞行ROSA公司nT-nG（纳克）和Emx1乘员Lmnb1飞行/飞行ROSA公司nT-nG（纳克）用抗caspase 3（凋亡细胞死亡的标志物；绿色）抗体染色切片后的小鼠胚胎。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3仅限于CP神经元，在VZ细胞中不存在。DNA用DAPI（蓝色）染色。（比例尺，100μm）
图2。
图2。
LAP2β表达最小1−/−（B1KO）胚胎。(A类)免疫荧光显微镜最小1+/+（重量）和最小1−/−（B1KO）神经元，用抗LAP2β抗体染色细胞（白色）。红色箭头指向B1KO神经元，其LAP2β水平较低，和/或沿核边缘异常分布。（比例尺，10μm）(B类)的成绩单级别Tmpo公司（LAP2β基因）在WT和B1KO神经元中。神经元在培养基中分化48小时。转录水平标准化为Ppia公司抄本。条形图显示平均值±SEM；n个=3个独立实验***P（P）<0.0005; 未成对学生的t吨测试。(C类)用LAP2β抗体染色细胞后，对表达NLS-GFP（绿色）的B1KO神经元进行免疫荧光显微镜检查。在顶部行，LAP2β为白色；在中底部第行，LAP2β为红色。黄色箭头指向NM破裂的神经元。NM破裂神经元中LAP2β水平较低。（比例尺，10μm）
图3。
图3。
用siLAP2β（一种小干扰RNA）降低层粘连B1缺陷（B1KO）神经元中LAP2？的表达Tmpo公司)增加NM破裂，导致更多细胞死亡。(A类)的成绩单级别特姆波在里面最小1+/+转染siLAP2β或对照siRNA（siControl）的（WT）和B1KO神经元。Bar表示两个实验的平均值；dots显示了两个独立实验的结果；转录水平标准化为Ppia公司抄本。转染24小时后检测神经元。(B类)转染siLAP2β或siControl的B1KO神经元的共焦显微照片。用LAP2β抗体对神经元进行染色左侧; 合并图像中为红色）。DNA用DAPI（蓝色）染色。（比例尺，10μm）(C类)NM破裂时siLAP2β或siControl-转染B1KO神经元的百分比***P（P）<0.0005; χ2测试。平均值±SEM；n个=3个独立实验；20小时成像/实验。点表示三个独立实验中的百分比。在三个独立实验中，共分析了150个siLAP2β转染神经元和125个对照siRNA转染神经元。(D类)NM破裂总数与计数神经元数的比率。点表示三个独立实验中的比率*P（P）<0.05; 未成对学生的t吨测试。在三个独立实验中，共分析了150个siLAP2β转染神经元和125个对照siRNA转染神经元。(E类和F类)条形图描述了NM断裂之间的平均时间(E类)NM破裂的平均持续时间(F类)在siLAP2β或siControl-转染的B1KO神经元中（平均值±SD；>35 NM的破裂分析/组）***P（P）<0.0005; 未成对学生的t吨测试。(G公司)表达NLS-GFP的siLAP2β或siControl-转染B1KO神经元的共焦显微照片（白色）。在siLAP2β转染的B1KO神经元中观察到大量NM破裂（明显表现为GFP逃逸到细胞质和/或细胞核内GFP荧光突然消失；黄色箭头）。（比例尺，25μm）(H（H）)抗LAP2β（红色）和caspase 3（白色）抗体染色后siLAP2？或siControl-转染B1KO神经元的共焦显微照片；DNA用DAPI（蓝色）染色。（比例尺，20μm）
图4。
图4。
分化的B1KO神经元中较高水平的LAP2β表达可防止NM破裂。用编码LAP2β-td番茄融合蛋白的慢病毒转导WT和B1KO神经元。(A类)非转导和LAP2β-td番茄转导B1KO神经元的荧光强度。平均值±标准偏差***P（P）< 0.0001; 未成对学生的t吨测试。用LAP2β抗体对神经元染色后，记录共焦显微照片，并用ImageJ分析10个图像。每个核的荧光强度被量化并归一化为核面积（单位：平方毫米）。(B类)非转导和LAP2β-td番茄转导B1KO神经元的免疫荧光显微镜。用LAP2β抗体对细胞进行染色（左侧; 合并图像中为红色）。DNA用DAPI（蓝色）染色。（比例尺，10μm）(C类)与LAP2β-td番茄慢病毒孵育的表达NLS-GFP的B1KO神经元（绿色）的时间-显微镜研究。神经元未进行药物选择；因此，一些神经元不表达LAP2β-tdTomato（红色）。(顶部)含有表达NLS-GFP-的B1KO神经元的区域的显微照片，这些神经元已成功用LAP2β-tdTomato转导。在表达LAP2β-tdTomato的表达NLS-GFP的B1KO神经元中从未观察到NM破裂。(底部)另一个区域的共焦显微照片，其中几个细胞表达NLS-GFP，但不表达LAP2β-tdtTomato。仅表达NLS-GFP的神经元出现NM破裂（明显表现为GFP逃逸到细胞质中）（洋红色箭头）。（比例尺，20μm）(D类)表达NLS-GFP的非转导B1KO神经元的百分比(n个=148）和LAP2β-td番茄转导的B1KO神经元(n个=101）至少有一个NM破裂（通过GFP逃逸到细胞质检测）。平均值±SEM；n个=3个独立实验；20小时成像/实验。点表示三个独立实验中的百分比***P（P）<0.0005; χ2测试。101个LAP2β-td番茄转导的B1KO神经元未检测到NM断裂。在这三个实验中，共评估了148个未转导的B1KO神经元。(E类)非转导和LAP2β-td番茄转导B1KO神经元NM破裂总数除以所分析神经元总数的比率。平均值±扫描电镜；n个=3个独立实验***P（P）<0.0005; 未成对学生的t吨测试。在LAP2β-td番茄转导的B1KO神经元中未观察到NM破裂。共评估了148个未转导的B1KO神经元。(F类)未转导和LAP2β-td番茄转导B1KO神经元与γH2AX病灶的百分比。共分析了240个LAP2β-tdTTomato转导的B1KO神经元和156个未转导的B1KO神经元。平均值±SEM；n个=3个独立实验***P（P）<0.0005; χ2测试。每个横条记录了被评分的神经元总数。(G公司)用LAP2β抗体（红色）和DNA损伤标记物γH2AX（白色）染色细胞后，非转导和LAP2？td番茄转导的B1KO神经元的共焦显微照片。（比例尺，10μm）
图5。
图5。
减少LAP2β的表达最小1−/−Lmnb2（磅2）−/−Lmna公司−/−成纤维细胞（TKO）与siLAP2β（一种针对Tmpo公司)增加NM破裂和细胞死亡的频率。(A类)的成绩单级别Tmpo公司转染siLAP2β或siControl的WT和TKO MEF中的（LAP2基因）。两个独立实验的平均值；dots显示了两个独立实验的结果；转录水平标准化为Ppia公司转染24小时后进行分析**P（P）< 0.005; 未成对学生的t吨测试。(B类)转染siLAP2β或siControl的TKO MEF的免疫荧光显微照片。MEF用LAP2β抗体染色（红色）。DNA用DAPI（蓝色）染色。（比例尺，50μm）(C类)siLAP2β-和对照siRNA转染的TKO MEF中至少有一个NM破裂的百分比。在三个独立实验分析的140个对照siRNA转染的TKO MEF中，在23个细胞中检测到NM破裂。在210个siLAP2β转染的TKO MEF中，60个细胞出现NM破裂。平均值±扫描电镜；n个=3个独立实验，圆点显示每个实验中的百分比（成像/实验20小时）**P（P）= 0.009; χ2测试。(D类)NM破裂总数与所评估MEF总数的比率。平均值±SEM；n个=3个独立实验，圆点显示每个实验中的比率（成像/实验20小时）。在三个实验中分析的140个对照siRNA转染的TKO MEF中，检测到58个NM破裂。在210个siLAP2β转染的TKO MEFs中，检测到213个NM破裂*P（P）<0.05; 未成对学生的t吨测试。(E类)siLAP2β或siControl-transfected TKO MEF的NM破裂持续时间（平均值±SD；>35 NM破裂/组）。(F类)siLAP2β或对照siRNA转染的TKO MEF中NM破裂并随后在成像20小时内死亡的百分比。平均值±SEM；n个=3个独立实验；点表示每个实验中的百分比。在23个显示NM破裂的对照siRNA转染的TKO MEF中，1人死亡。在60个显示NM破裂的siLAP2β转染的TKO MEF中，16人死亡*P（P）= 0.024; χ2测试。(G公司)表达NLS-GFP的siLAP2β或siControl-transfacted TKO MEF的共焦显微照片（白色）。在siLAP2β转染的TKO-MEFs中观察到许多NM断裂（品红色箭头），通过GFP逃逸到细胞质和/或细胞核内GFP荧光的突然丧失可以明显看出。（比例尺，25μm）(H（H）)显示核γH2AX病灶的siLAP2β或对照siRNA转染的TKO MEF的百分比。条形图描述了两个独立实验的平均值（140个对照siRNA转染的TKO MEF和173个siLAP2β转染的TKO MEFs得分）；圆点表示两个实验中的百分比。
图6。
图6。
用编码LAP2β-td番茄融合蛋白的慢病毒转导野生型和TKO MEF可防止NM破裂并减少DNA损伤。(A类)的成绩单级别Tmpo公司非转导或LAP2β-td番茄转导的TKO MEF（平均值±SEM；n个=3个独立实验）。成绩单水平标准化为Ppia公司成绩单**P（P）= 0.0079; 未成对学生的t吨测试。(B类)在20小时活细胞成像期间发生NM破裂事件的非转导和LAP2β-td番茄转导TKO MEF的百分比。在141例未转染的TKO MEF中，34例MEF发生NM破裂。在103个表达LAP2β-td番茄的MEF中，只有1个细胞发生NM破裂。三个独立实验（成像20小时/实验）的平均值±SEM***P（P）<0.0005; χ2测试。黑点表示每个实验中的百分比。(C类)TKO MEF和LAP2β-td番茄转导MEF中NM破裂数量与所分析细胞总数的比率。在141例未转染的TKO MEF中，有69例NM破裂。在103个表达LAP2β-td番茄的MEF中，只有一个NM破裂。三个独立实验的平均值±SEM**P（P）= 0.0055; 未成对学生的t吨测试。黑点表示每个实验中的比率。(D类)未转导和LAP2β-td番茄转导的TKO MEF与γH2AX病灶的百分比。三个独立实验的平均值±SEM***P（P）<0.0005; χ2测试。黑点表示每个实验中的比率。在三个独立的实验中，分析了50个非转导和101个LAP2β-td番茄表达的MEF。(E类)静态条件下，在PDMS膜上镀上NM破裂的未转导和LAP2β-td番茄转导TKO MEF的百分比。在172例未转染的TKO MEF中，29例MEF发生NM破裂。在195个表达LAP2β-td番茄的MEF中，没有NM破裂。所示为三个独立实验的平均百分比±SEM***P（P）<0.0001; χ2测试。黑点表示每个实验中的百分比。(F类)当细胞在PDMS膜上受到单轴拉伸2小时时，非转导和LAP2β-tdto番茄转导的TKO MEF发生NM破裂的百分比。在151个非转导TKO meF中，79个MEF发生了NM破裂。在198个表达LAP2β-td番茄的MEF中，有三个细胞发生NM破裂。显示了三个独立实验的平均值±SEM***P（P）<0.0001; χ2测试。黑点表示每个实验中的百分比。(G公司)静态和拉伸条件下非转导和LAP2β-td番茄转导TKO MEF的免疫荧光显微镜。TKO MEF仅表达NLS-GFP（绿色）或表达NLS-GFP和LAP2β-tdTomato（红色）。DNA用DAPI（蓝色）染色。洋红色箭头表示NM断裂。（比例尺，10μm）
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