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.2021年2月9日；118（6）：e2015654118。
doi:10.1073/pnas.2015654118。

SLFN11促进CUL4降解CDT1以应对复制性DNA损伤，而其缺失会导致ATR/CHK1抑制剂的合成致死性

Ukhyun Jo公司 1, 村井裕久 2, 西里莎·查卡 三, 陆晨 三, Ken Cheng（肯·程） 三, 村井俊子 4, 利顿·库马尔·萨哈 2, 丽莎·米勒·詹金斯 5, 伊威斯·波米尔 1
附属公司

SLFN11促进CUL4降解CDT1以应对复制性DNA损伤，而其缺失会导致ATR/CHK1抑制剂的合成致死性

Ukhyun Jo等。 美国国家科学院程序. .

摘要

约50%的癌细胞中Schlafen-11（SLFN11）失活可产生广泛的化疗耐药性。为了确定克服化疗耐药性的治疗靶点和潜在分子机制，我们在SLFN11型-WT和-knockout（KO）细胞。我们发现共济失调-毛细血管扩张症和Rad3相关（ATR）、CHK1、BRCA2和RPA1的失活克服了对喜树碱（CPT）的化学耐药性SLFN11型-KO电池。因此，我们验证了ATR临床抑制剂（M4344和M6620）和CHK1（SRA737）的再敏感性SLFN11型-KO细胞与拓扑替康、吲哚替康、依托泊苷、顺铂和他拉唑帕利的结合。我们发现ATR抑制显著增加了有丝分裂缺陷，同时CDT1磷酸化增加，从而破坏了细胞内动粒微管附着的稳定性SLFN11型-KO电池。我们还揭示了CDT1降解被延缓的一种耐药机制，最终在DNA损伤下诱导复制重新激活SLFN11型-KO电池。相反，在表达SLFN11的细胞中，SLFN1通过与CUL4的DDB1结合来促进CDT1的降解，以响应CPTCDT2型与复制叉相关的E3泛素连接酶。我们发现SLFN11的C末端和ATP酶结构域是DDB1结合和CDT1降解所必需的。此外，我们发现了一个与治疗相关的ATP酶突变体（E669K）SLFN11型人类TCGA中的基因，并表明该突变有助于化疗耐药和延缓CDT1降解。综上所述，我们的研究揭示了针对ATR通路如何克服SLFN11缺陷癌症的化疗耐药性的新的化疗见解。它还表明，SLFN11通过DDB1-CUL4降解CDT1不可逆转地阻止复制CDT2型泛素连接酶。

关键词：ATR/CHK1抑制剂；CDT1；CUL4；SLFN11。

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利益冲突声明

作者声明没有竞争性利益。

数字

图1。
图1。
全基因组RNAi筛选确定ATR通路是克服SLFN11缺陷细胞化疗耐药性的协同靶点。(A类)DU145 WT和SLFN11型KO电池。(B类和C类)的排名分布图z（z）-细胞活力得分（CPT治疗/未治疗）SLFN11型-KO公司(B类)和-WT(C类)单元格(数据集S1). 黑点：单个siRNA靶基因。红点：点击选择的基因进行进一步验证。(天)蛋白质相互作用网络与RNAi屏幕点击SLFN11型-STRING分析生成的KO细胞。线条粗细代表数据可信度的强度。(电子)分子网络的GO分析SLFN11型-KO电池。(如果——H（H）)化学敏感性验证SLFN11型-WT和KO电池。用三种靶向性siRNA转染细胞自动标签阅读器，CHK1号机组、和巴西航空公司2然后用指示浓度的CPT处理72 h。用CellTiter-Glo（Promega）分析细胞活力。误差条代表SD(n个= 3).
图2。
图2。
ATR通路的临床抑制剂持续使SLFN11缺陷细胞对临床DNA损伤剂重新敏感。(A类——C类，上部)DU145型SLFN11型-用M4344（25 nM）和指示浓度的TOP1抑制剂CPT、TPT和吲哚替康（LMP400）处理WT和-KO细胞72 h。用CellTiter-Glo分析细胞活力。误差条代表SD(n个= 3). (下部)根据细胞存活率数据计算的组合指数（CI）与Fa（受影响分数）。(天)M4344（1 nM）与等基因WT和SLFN11型-KO白血病淋巴母细胞CCRF-CEM细胞。(电子)在小细胞肺癌DMS114细胞中联合使用M4344（25 nM）和指定浓度的CPT。(如果——H（H）)用M4344（25 nM）处理DU145细胞，并用CellTiter-Glo分析所示浓度的足叶乙甙、他拉唑帕利和顺铂72 h。误差条代表SD(n个= 3).
图3。
图3。
在用CPT处理的SLFN11缺陷细胞中，ATR的抑制导致DNA损伤和CDT1过度磷酸化的染色体缺陷增加。(A类)DU145中γH2AX的共焦免疫荧光染色SLFN11型-用CPT（100 nM）和M4344（25 nM）处理WT和-KO细胞24小时(上部)代表性图像（γH2AX绿色）。（放大倍数，63倍）。(下部)γH2AX信号由ImageJ量化。误差条代表SD(n个≥ 50); ****P（P）<0.0001学生t吨测试；ns，不显著。(B类)CPT和M4344处理细胞24小时后细胞核的共聚焦免疫荧光染色(上部)细胞核/单个细胞的代表性图像（放大63倍），标记为DAPI（蓝色）。(下部)药物治疗后多核细胞百分比(n个= 100). (C类)中期排列的共聚焦免疫荧光染色SLFN11型-KO细胞经CPT和M4344处理16 h后，有丝分裂纺锤体用α-微管蛋白（绿色）染色，染色体用DAPI（蓝色）染色。（放大倍数，63倍）。(天)用CPT和M4344处理24小时后，通过流式细胞仪分析细胞周期分布。数据显示为平均值。误差条代表SD(n个= 3). (电子)流式细胞术分析相对EdU掺入量。在收获之前，用CPT和M4344处理细胞24小时，并用Edu（10µM）脉冲处理30分钟。误差条代表SD(n个= 3). **P（P）< 0.009, ****P（P）<0.0001学生t吨测试。(如果)用CPT和M4344治疗24小时后DNA复制起始因子的蛋白表达水平(G公司)CPT和M4344联合处理对CDT1电泳迁移的抑制作用SLFN11型-KO细胞是由于过度磷酸化所致。SLFN11型-KO细胞用CPT和M4344处理24小时，然后用SAP（1 U/µL）孵育。(H（H）)CDT1对CPT和M4344联合治疗的过度磷酸化反应是由CDK介导的。SLFN11型-KO细胞用CPT、M4344和罗斯科维汀（20µM）处理24 h，然后通过Western blotting进行分析。(我)CDT1在与CPT和M4344联合治疗后以时间依赖性的方式过度磷酸化。
图4。
图4。
CDT1降解缺陷导致SLFN11缺陷细胞中的复制恢复。(A类)DU145型SLFN11型-用指示浓度的CPT处理WT和-KO细胞4小时。蛋白质水平通过Western blotting分析。(B类)DU145型SLFN11型-用CPT（100 nM）处理WT和-KO细胞达指定时间。蛋白质表达水平通过Western blotting分析。(C类)CDT1的定量如所示B类条形图显示了三次实验的平均带强度，并归一化为GAPDH*P（P）< 0.0274, **P（P）< 0.0077. (天)教育程度百分比+流式细胞术检测CPT治疗时间进程中的S期细胞。误差条代表SD(n个= 3). *P（P）< 0.0335, **P（P）< 0.0025, ***P（P）<0.0005学生t吨测试。(电子，上部)DNA结合分析的标记协议。用CPT（100 nM）处理细胞16 h，然后依次用IdU（100µM）和CldU（100μM）脉冲标记细胞1 h(下部)新来源的频率仅由CldU脉冲标记。误差条代表SD(n个= 3). ***P（P）<0.0009学生t吨测试。(如果)依赖CDT1的复制恢复。SLFN11型-用siControl（Ctrl）或si转染KO细胞CDT1型48小时，然后用CPT处理24小时。细胞在收获前用EdU（10µM）培养30分钟。EdU的百分比+和DAPI+流式细胞术检测细胞数。(G公司)教育部量化+S期细胞。误差条代表SD(n个= 3). ***P（P）<0.0009学生t吨测试。(H（H），上部)治疗方案。用CPT处理细胞24小时，并在CPT处理4小时后用Cdc7抑制剂（PHA-767491，5µM）处理细胞。细胞在收获前用EdU（10µM）培养30分钟。教育程度百分比+和DAPI+流式细胞术检测细胞数。(我)教育部量化+S期细胞。误差条代表SD(n个= 3). **P（P）<0.008学生t吨测试。
图5。
图5。
SLFN11通过结合CUL4–DDB1复合物促进CDT1降解，以应对复制性DNA损伤。(A类)SLFN11的代表性互动者。用CPT处理DU145细胞16 h。用抗SLFN11抗体免疫沉淀核细胞裂解物，并用质谱分析。(B类)将转染DDB1-Flag构建物的HEK293细胞用CPT（10µM）和MG132（20µM。通过Western blotting分析相互作用蛋白。(C类)在DU145细胞中用CPT（10µM）和MG132（20µM。(天，顶部)DDB1-Flag和SLFN11缺失突变体图。(中部)将转染DDB1-Flag的293T细胞和指示的SLFN11构建物用CPT（10µM）和MG132（20µM。(底部)同上，但使用检测SLFN11 C末端区域的抗SLFN11-抗体（E4）。蛋白质印迹鉴定相互作用蛋白。(电子)用CPT（100 nM）和M4344处理稳定转染载体SLFN11和SLFN11-E669Q构建物的K562细胞24小时。蛋白质通过Western blotting鉴定。(如果)用CPT和M4344处理稳定转染载体SLFN11-WT或SLFN11-E669Q构建物的K562细胞72 h。用CellTiter-Glo分析细胞活力。(G公司)SLFN11-E669Q与DDB1相互作用。用DDB1 Flag、SLFN11-WT和-E669Q瞬时转染293T细胞48小时。在用CPT（10µM）和MG132（20µM。(H（H）)TCGA中SLFN11突变图。(我)用CPT和M4344处理转染SLFN11-WT、SLFN11-E669Q或SLFN112-E669K构建物的293T细胞48小时，然后用CellTiter-Glo分析细胞活力。
图6。
图6。
SLFN11介导的复制再激活阻断和ATR/CHK1抑制剂在SLFN11阴性癌细胞中的合成致死性的拟议模型。在SLFN11阳性细胞中，SLFN1通过DNA损伤被征募到染色质中。随后与DDB1结合，并作为活化DDB1–CUL4的辅因子促进CDT1和其他底物的降解CDT2型因此，CDT1介导的复制恢复被不可逆转地阻止，导致对DNA损伤剂的敏感性。相反，在SLFN11缺陷细胞中，DDB1–CUL4CDT2型-介导的CDT1降解减少。然后，CDT1通过激活休眠来源促进复制恢复，从而产生化学耐药性。ATR/CHK1抑制剂通过CDT1磷酸化诱导早期复制和有丝分裂，从而导致有丝分裂突变和细胞死亡，从而逆转SLFN11缺陷细胞的化疗耐药性。
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引用人

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