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.2018年5月；189(5):505-518.
doi:10.1667/RR14963.1。 Epub 2018年2月23日。

基于多重质谱的DNA损伤磷化定量分析

杰弗里·怀特克 1, 雷昭（Lei Zhao） 1, 里克·索尔 2, Jan A Kaczmarczyk先生 2, Regine M Schoenherr女士 1, 希瑟·D·摩尔 1, 科里·琼斯·韦纳 1, 理查德·艾维 1, 陈伟林 1, 塔拉·希尔特克 三, Kerryn W Reding公司 1 4, 戈登·怀特利 2, 王培（音译） 5, 阿曼达·G·保罗维奇 1
附属公司

一种基于多重质谱的检测方法，用于响应DNA损伤的磷酸信号的稳健定量

杰弗里·怀特克等。 辐射Res. 2018年5月.

摘要

缺乏分析稳健和多重分析，阻碍了对DNA损伤反应的大型分支磷酸信号网络的研究。为了满足这一需求，我们开发了一种62-plex分析方法，用于量化DNA损伤诱导后的蛋白质表达和翻译后修饰（磷酸化和泛素化）。线性范围超过3个数量级，平均组间变异性为10%CV，大多数（～85%）分析在长期储存后保持稳定。多重分析应用于原理验证研究，以量化永生化细胞系和原始人类细胞暴露于遗传毒性应激（电离辐射和4-硝基喹啉1-氧化物）后的信号传导。使用该试验分析基因组变异和药物激酶抑制（ATM/ATR）的作用。本研究证明了定量复合分析在研究细胞信号动力学方面的实用性，以及在辐射反应的诱导间变异研究中的潜在应用。

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数字

图1
图1
免疫-MRM分析工作流程概述。使用符合下游质谱分析的程序从生物样品中提取蛋白质。然后，通常使用胰蛋白酶对蛋白质裂解物进行酶消化，并以已知数量添加与每个分析物相对应的稳定同位素标记的标准肽（即重肽），作为内部标准。使用与磁珠耦合的抗肽抗体从复杂样品中富集分析物肽及其稳定同位素类似物。富集分析物和标准物的测量是通过液相色谱（LC）和定量质谱（MS）结合使用一种称为多重反应监测（MRM）的靶向技术进行的。峰面积比（轻内源性分析物肽与重肽）用于定量。特异性由轻（内源性）和重（标准）肽的等效保留时间和相对过渡区确定。
图2
图2
使用复合分析量化因基因组突变和/或激酶的药物抑制引起的细胞信号辐射诱导变化。来源于野生型的人淋巴母细胞系(自动取款机+/+，GM07057）和ATM缺陷(自动取款机−/−，GM01526）患者在5Gy照射摄动后的一段时间内（1、6、24 h）采集。文化自动取款机+/+另外用ATM激酶抑制剂KU-55933（或对照载体DMSO）处理细胞。A组：三个生物复制品的平均峰面积比的热图，在每个肽的样品之间进行标准化。绘制LLOQ以上所有时间点检测到的分析物。组“1”：与基因组变体相比，抑制剂存在时反应降低的分析物。第2组：遗传变异中表达水平增加的分析物(自动取款机−/−)与在激酶抑制剂存在下处理的野生型细胞相比。B组：DDR组中选定的非磷酸化和磷酸化肽的峰面积比（轻：重），变化超过两倍(对< 0.05). 误差条是三个生物复制品的标准偏差。LLOQ由灰色虚线表示。
图3
图3
使用多重分析量化对4-硝基喹啉1-氧化物（4NQO）的反应。用4NQO处理人淋巴母细胞系，并用生物一式三份的62倍免疫MRM分析法对DDR进行分析。对照样品未接受任何处理，2h后采集4NQO处理的样品。标记为“AZD6738”的样品指在ATR激酶抑制剂存在的情况下进行的处理，标记为“DMSO”的样品仅含有载体。A组：热图显示4-硝基喹啉1-氧化物诱导的DNA损伤反应和AZD6738的作用。在所有条件下，LLOQ上方检测到的分析物均绘制在热图中。B组：对照组（绿色）的峰面积比（轻：重），4NQO（橙色），4NQO与溶媒（棕色）和4NQ0与抑制剂（黑色）处理。误差线是三个生物复制品的标准偏差。LLOQ由灰色虚线表示。
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