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.2017年10月1日；77(19):5327-5338.
doi:10.1158/0008-5472.CAN-17-1355。 Epub 2017年8月17日。

MRE11通过促进对癌基因诱导复制应激的抵抗而促进肿瘤发生

伊丽莎白·斯皮尔斯基 1 2, Kayla M Capper公司 三, 谢丽尔·史密斯 4, 玛丽·摩根 1 2, 玛丽亚·丁克尔曼 1, 杰弗里·布伊斯 1, JoAnn M Sekiguchi先生 5 6, 大卫·O·弗格森 7
附属公司

MRE11通过促进对癌基因诱导复制应激的抵抗而促进肿瘤发生

伊丽莎白·斯皮尔斯基等。 癌症研究. .

摘要

编码MRE11/RAD50/NBS1（MRN）DNA修复复合体的基因的低形态突变导致致癌综合征。MRN结合DNA双链断裂，在修复中发挥作用，并通过激活共济失调-扩张症突变激酶触发细胞周期检查点。为了了解癌症中的MRN，我们用缺乏MRN的B淋巴细胞或含有MRE11缺乏核酸酶活性的MRN的小鼠进行了改造。这两种形式的MRN缺乏都会导致癌症的特征，包括涉及c-Myc和免疫球蛋白基因座的致癌易位。即使在没有p53的情况下，这些癌前B淋巴细胞也没有进展为可检测的B系淋巴瘤。此外，Mre11缺陷可阻止自发性B细胞淋巴瘤小鼠模型的肿瘤发生。我们的研究结果表明，MRN不能被视为标准的肿瘤抑制因子，相反，MRE11的核酸酶活性是肿瘤发生所必需的。抑制MRE11核酸酶活性会增加DNA损伤，并选择性诱导癌基因过度表达的细胞凋亡，这表明MRE11在对抗癌基因诱导的复制应激中起着重要作用。因此，MRE11可能为癌症治疗发展提供靶点。更广泛地说，我们的工作支持这样一种观点，即内源性基因组不稳定性的细微增强可能会超过癌细胞的耐受能力，并被用于治疗目的。癌症研究；77(19); 5327-38. ©2017 AACR版权所有.

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利益冲突声明。提交人声明，不存在利益冲突。

数字

图1
图1。缺乏p53的MRE11缺陷型B细胞的同型转换和末端连接仍然存在缺陷
A） 哺乳动物MRE11结构域和核酸酶活性所需的不变组氨酸的位置（顶部）。四种小鼠生殖系Mre11型本研究中使用的和之前描述的等位基因（底部）（19）。红色矩形，外显子5（灰盒）中的组氨酸对核酸酶活性至关重要；线，内含子；三角形，LoxP位点；星号，H129N核酸酶死亡突变。（B） 受刺激的原发性脾脏B细胞中的同种型类别转换。定量所示基因型的IgG1+B细胞百分比。3个独立实验的平均值±标准误差。原代脾B细胞培养，然后用α-CD40/IL-4刺激以诱导类别转换。用α-B220和α-IgG1抗体流式细胞术分析CSR对IgG1的影响。（C） IgH基因座内突变的双色FISH分析。星号，使用位于IgH基因座3′（红色）和5′（绿色）的BAC发出的荧光信号，由于染色体断裂而分离。（D） 定量显示基因型的受刺激B细胞中含有IgH断裂的中期百分比。数据表示来自3个独立实验的分析。>每个基因型100个中期。*，p≤0.05（双尾T检验）。
图2
图2。p53和B细胞Mre11联合缺陷小鼠的生存和肿瘤发生
（A） 代表Mre11 B细胞基因型小鼠存活率的Kaplan-Meier图−/−（中位生存期27.5个月，p=0.72）和Mre11H129N/−（中位生存期，29个月，p=0.50），p53野生型背景。Mantel-Cox的p值，对数秩检验。（B） p53小鼠的图（A）−/−Mre11型−/−和p53−/−Mre11型H129N/−B细胞基因型与p53−/−Mre11型+/−对照组中位生存期分别为17.5周（p=0.36）和18.5周（p=0.25）。（C） 所示B细胞基因型小鼠的死亡原因。没有小鼠患上B细胞淋巴瘤。（D）Mre11型B细胞特异性突变抑制原B淋巴瘤阿耳特弥斯/p53双空背景。Kaplan-Meier生存曲线表示小鼠存活率与周龄的比值。野生型（n=20），Artemis−/−（n=9），阿耳特弥斯−/−第53页−/−（n=9），和阿耳特弥斯小鼠−/−第53页−/−Mre11型−/−（n=11）和阿尔忒弥斯−/−第53页−/−Mre11型H129N/−（n=11）在30周内观察B细胞基因型。阿耳特弥斯−/−第53页−/−Mre11型条件/−和阿耳特弥斯−/−第53页−/−Mre11型秒/H129N携带CD19-cre转基因的小鼠比Artemis存活时间更长−/−第53页−/−小鼠（p≤0.01，Mantel-Cox，对数秩检验）。（E） 年死亡原因和肿瘤类型表阿耳特弥斯/p53/Mre11突变小鼠。阿耳特弥斯未发现B前淋巴瘤−/−第53页−/−生殖系Mre11小鼠条件/−或Mre11秒/H129N等位基因和CD19-cre（p≤0.0001，Fisher精确双尾检验）。阿耳特弥斯的数据−/−第53页−/−来自本研究的小鼠和参考文献35。
图3
图3。Mre11-缺陷细胞的易位检测
（A） 双色FISH-IgH易位分析示意图。分离端粒（绿色）和着丝粒（红色）IgH探针并将其定位于不同的染色体时，对易位进行评分。（B） Mre11中易位的定量+/−，Mre11−/−和Mre11H129N/−p53中的B细胞−/−背景。数据来自3个独立实验，>100个中期/样本。（C） IgH:Myc易位PCR示意图。Myc外显子1和IgH基因座Sμ两侧的嵌套引物（箭头）检测两个基因座之间的易位。探针、棒。（D） 所示的B电池Mre11型在培养基中刺激基因型进行CSR。巢式PCR产物用chr进行Southern印迹分析。12（IgH）和chr。15（Myc）探针。（E） 顶部，基于PCR检测I-SceI内切酶诱导的易位示意图。巢式PCR引物检测随机整合的I-SceI位点（黑箭头）和细胞内内源性、隐蔽的I-Sce位点之间的易位24毫米chr上的轨迹（开放箭头）。2.表达Mre11的细胞巢式PCR产物的底部EtBr染色琼脂糖凝胶重量，Mre11H129N型或无Mre11（−）。添加Ad I-SceI和嵌套的（2）或仅第一轮的（1）PCR引物。（F） Mre11的自发性染色体异常−/−和Mre11−/−艺术−/−MEF公司。中期用DAPI染色，并对染色体异常进行盲法评分。条形图，每个中期的异常数量；异常类型，如配色方案所示。数据来自3个独立实验。
图4
图4。癌基因过度表达细胞中Mre11依赖性增殖和DNA损伤反应
（A） Mre11型康德/+和Mre11条件/−表达MYC或大T抗原的MEF用腺核处理以删除条件Mre11型等位基因。Mre11的存活率（%）+/−和Mre11−/−与腺体空白处理对照培养物相关的细胞绘制为天数的函数。3个独立实验的平均值±SEM。（B） 以腺核或腺空作为对照，处理原发性MEF或表达MYC或大T抗原的MEF，并使用β-半乳糖苷酶比色法测量经历衰老的细胞百分比。3个独立实验的平均值±SEM。如括号所示，使用了2条独立衍生的MEF线。（C） DNA修复检测的重点是MYC在人类细胞中的过度表达。用DMSO或200nM 4-OHT处理U2OS-pBABE和U2OS-MYC-ER细胞以诱导MYC易位到细胞核。免疫荧光显微镜检测DNA修复蛋白在DNA损伤部位的定位。绘制了带有γH2AX（C）、53BP1（D）、RPA（E）、FANCD2（F）、BRCA1（G）和NBS1（H）焦点的核的百分比。3个或更多独立实验的平均值±SEM。*，p≤0.05；配对t检验。
图5
图5。癌基因过度表达细胞中Mre11缺失或抑制降低细胞存活率
（A） 小分子抑制剂mirin对MRE11核酸酶活性的抑制可降低过表达癌基因的细胞的存活率。Mre11型条件/−和Mre11条件/−阿耳特弥斯−/−用对照逆转录病毒（空载体，EV）或表达逆转录病毒的逆转录病毒转导MEFMYC公司或N-马来西亚然后用mirin或载体处理24h。对活细胞进行计数，绘制相对于未转导细胞的存活率（mirin/DMSO）。3个或更多独立实验的平均值±SEM。*，p≤0.05。（B） MYC过表达的人U2OS细胞经mirin处理后存活率降低。U2OS-pBABE和U2OS-MYC-ER细胞经DMSO或4-OHT处理72小时，然后随着mirin浓度的增加处理24小时。与对照组相比，测定48小时后的细胞存活率。图表表示3个独立实验的平均值±SEM*p≤0.05。（C） 细胞按B处理，用流式细胞术测定膜联蛋白V阳性细胞百分率。将（D-E）U2OS-cMycER细胞作为in-C处理。用免疫荧光显微镜检查53BP1（D）和NBS1（E）在DNA修复灶中的定位。绘制了显示DNA修复病灶的细胞核百分比。3个独立实验的平均值+SEM。*，p＜0.05；配对t检验。
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