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.2018;14(5):764-777.
doi:10.1080/15548627.2017.1314897。 Epub 2018年3月6日。

Atg9a缺乏导致轴突特异性损伤，包括神经回路发育不全

山口俊二 1, 铃木Chigure 2, Tomohisa Nanao公司 三, Soichirou Kakuta公司 1, 小泽肯塔鲁 4, 伊塞·塔尼达 2, Tatsuya Saitoh公司 5, 竹本武彦 2, 小松Masaaki 6, 田中庆二 7, 青木茂 8, 坂村贤治 9, 内山雅雄 1
附属公司

Atg9a缺乏导致轴突特异性损伤，包括神经回路发育不全

山口俊二等。 自噬. 2018.

摘要

为了了解Atg9a在神经组织细胞中的作用，产生了Atg9a的条件性敲除小鼠，特别是在脑组织中。这些小鼠出生正常，但其中一半在一周内死亡，没有一只寿命超过4周。SQSTM1/p62和NBR1，选择性自噬的受体蛋白，以及泛素，在出生后第15天（P15）在Atg9a缺陷性神经瘤中积累，表明自噬受到抑制，而这些蛋白在P28时显著降低，免疫组织化学、电子显微镜和western blot证实了这一点。相反，尽管在神经元细胞体中未检测到明显的退行性变化，但在P28处被异常膜结构和无定形材料占据的轴突及其末端发生了退行性改变，如神经纤维束海绵样变性。与自噬不同，弥散张量磁共振成像和组织学观察显示Atg9a-缺乏诱导胼胝体和前连合发育不全。至于原代培养神经元的轴突延伸，在atg9a-KO小鼠大脑的原代神经元中，培养3d后的轴突生长显著受损，而在atg7-KO和atg16l1-KO大脑中则没有。此外，在atg7-KO背景下的Atg9a-敲除神经元中也证实了这一趋势，表明Atg9a在调节不依赖自噬的突起生长中的作用。这些结果表明，Atg9a缺乏会导致轴突及其终末的进行性退化，但不会导致神经元胞体的退化，因为神经元胞体中SQSTM1/p62和NBR1的降解没有得到充分抑制。此外，Atg9a的缺失损害了神经纤维束的形成。

关键词：Atg9a；轴突；条件敲除小鼠；退化；弥散张量MRI；连合纤维发育不全；非选择性自噬；选择性自噬；海绵症。

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数字

图1。
图1。
小鼠的世代和表型atg9a对中枢神经系统组织具有特异性的条件性KO。（A） 野生型、flox和突变等位基因的示意图在9a基因。绿色三角形表示loxP序列。（B） 野生型基因组DNA的PCR分析，在9aF类/+和在9a前/后老鼠尾巴。（C） 生存曲线atg9a-CKO公司(在9a前/后:Nes-Cre公司),第7天-CKO公司(附件7前/后:Nes-Cre公司)和漂浮的对照小鼠（atg9a-CKO小鼠和第7天-未表达Cre重组酶的CKO小鼠）。使用的小白鼠数量为45只用于窝友漂浮物控制，15只用于atg9a-CKO小鼠。（D） floxed控件的代表性图片(在9a如果/+Cre-/-）（较大的）和atg9a-第15页（左侧）CKO（较小的一只）小鼠。体重的变化atg9a-CKO小鼠及其漂浮的对照同窝小鼠出生后4周。结果表示为平均值±SEM（n≥5，出生后每d）（右）。使用学生进行统计分析t吨测试。（E） 使用牙线的对照组的体重比较，atg7型-CKO和atg9a-CKO小鼠出生后2周。结果表示为平均值±SEM（n≥8，出生后每d）。使用单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析，然后进行Tukey Kramer事后检验。（F） floxed control和atg9a-第28页CKO小鼠。（G） 旋转木马性能测试。条形图显示了atg9a-CKO（白条）和漂浮控制（黑条）小鼠可以停留在旋转杆上。结果表示为平均值±SEM n=6（在floxed control中）和3（在atg9a-第21页CKO小鼠**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001. 使用学生进行统计分析t吨测试。
图2。
图2。
泛素、SQSTM1和NBR1在atg9a-CKO鼠脑。（A） 大鼠DCN神经元中SQSTM1、泛素和NBR1的免疫荧光atg9a-CKO小鼠P15。白色箭头表示这些蛋白质的阳性信号共定位。比例尺：20μm。（B） DCN神经元的电子显微照片atg9a-CKO小鼠大脑P15。上面板中的正方形在下面板中被放大。两幅图中的星号表示由ER包围的泛素聚集体。比例尺：1μm。（C） floxed对照组大脑皮层泛素、SQSTM1和NBR1的免疫染色，atg7型-CKO和atg9a-2周龄和4周龄CKO小鼠。比例尺：20µm。（D） 来自悬浮对照的脑裂解物中泛素、SQSTM1、NBR1、ATG7、ATG9A和MAP1LC3A/B的蛋白质印迹分析，第7天-CKO和atg9a-2周龄和4周龄CKO小鼠。肌动蛋白免疫染色用于内部控制。（E） SQSTM1和NBR1各蛋白带的定量。结果表示为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，ns，不显著，每个n=3。使用学生进行统计分析t吨测试。
图3。
图3。
Purkinje细胞轴突及其末端的形态学变化。（A） 条形图显示了Purkinje细胞轴突末端与DCN神经元接触区的长度atg9a-CKO小鼠P15和P28。结果表示为平均值±SEM。（n=10-15个轴突末端）**P（P）< 0.01. 采用单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析，然后进行Tukey-Kramer事后检验。（B） DCN中CALB和SLC32A1/VGAT的免疫反应性atg9a-CKO小鼠处于P28。插图显示轴突末端扩大，SLC32A1/VGAT（箭头）染色阳性。比例尺：50μm。（C，D）DCN中球体的电子显微照片atg9a-CKO小鼠（C）和轴突末端的floxed控件和atg9a-CKO小鼠（D）P28。一个有薄层髓鞘的球体上有各种形状的小泡和空泡（C），而在漂浮的控制DCN中有一个突触区，在漂浮的对照DCN中则有一个大的突触区具有无定形结构或退化的线粒体atg9a-CKO DCN显示（D）。显示了具有电子致密物质的退化线粒体，并在这些线粒体附近检测到异常的膜结构（白色箭头）。一些结构被双层膜包围（白色箭头）。插图显示方形部分，其中显示对比度低的线粒体。比例尺：1μm。（E，F）小脑白质（E）和DCN（F）的轴突海绵状改变在9a-CKO鼠标。绒毛对照组白质的HE染色和atg9a-CKO小鼠小脑（E）和floxed control和atg9a-CKO小鼠小脑（F）。电子显微照片显示，大的肿胀轴突在白质（E，右）和DCN（F，右）中含有高电子密度物质。比例尺：（E和F）中的光学显微镜为50μm，（E和F）中的电子显微镜为5μm。
图4。
图4。
胼胝体和前连合发育不全。（A，B）漂浮对照组胼胝体（CC；红色）、前连合（AC；绿色）和后连合（PC；蓝色）的扩散张量纤维束成像（A）和atg9a-CKO（B）小鼠大脑P21。矢状方向（左）和冠状方向（右）。（C至F）胼胝体（C，D）和前连合（E，F）的完整和不发育的形状，来自于漂浮对照和atg9a-第28页CKO小鼠。髓磷脂碱性蛋白和磷酸化神经丝的HE染色（C，E）和免疫荧光染色（D，F）。黑白虚线表示各自的神经纤维。LV，侧脑室；3V，第三脑室。比例尺：200μm。
图5。
图5。
发育中的大脑胼胝体和前连合发育不全。（A至C）正在发育的漂浮控制脑胼胝体（CC）和atg9a-CKO大脑位于E18。磷酸化神经丝（NF）（B）、GFAP阳性星形胶质细胞和AIF1/IBA1阳性小胶质细胞（C）的HE（A）和免疫荧光染色。LV表示侧脑室，Pb表示Probst束。（D） 游离对照脑发育中的前连合（AC），且大脑各区域无交叉神经纤维atg9a-CKO大脑位于E18。3V，第三脑室。（E） 用苏木精-伊红染色法观察floxed对照组和在9a-CKO大脑位于E18。比例尺：200μm（A、B、D）和50μm（C、E）。
图6。
图6。
原代培养皮层神经元的轴突延伸受损。（A） 从每个敲除小鼠胚胎（对照组）的对照窝获得的原代培养皮层神经元的代表性图片，atg9a-,第7天-和atg16l1-E14.5的普通KO小鼠胚胎。在1 DIV处用GFP表达载体转染每个PCN，并在3 DIV处观察。（B）从每个对照同窝胚胎和atg9a-E14.5时KO小鼠胚胎。每个PCN在3 DIV时转染GFP表达载体，在7 DIV时观察。比例尺：50μm。（C） A中PCN最长神经突的量化。结果表示为平均值±SEM n=每个神经元20至74个*P（P）< 0.05,** P（P）<0.01，ns，不显著。采用单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析，然后进行Tukey-Kramer事后检验。（D） Western blot分析转染si-RNA探针的WT MEF裂解液中的ATG9A（对照组和在9a[#1至3]）。肌动蛋白免疫染色用于内部控制（左）。ATG9A蛋白带的定量。结果表示为平均值±SEM**P（P）<0.01，（每个n=3）（右）。采用单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析，然后进行Tukey-Kramer事后检验。（E） 转染GFP表达载体的原代培养皮层神经元和对照或在9asi-RNA探针（控制和在9a[#3]）从WT胚胎和第7天-E14.5的普通KO小鼠胚胎。每个PCN在1DIV转染，固定，GFP免疫染色后在4DIV测定。（F） E中PCN最长神经突的量化结果表示为平均值±SEM n=20至24个神经元。** P（P）<0.01，ns，不显著。采用单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析，然后进行Tukey-Kramer事后检验。
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