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.2016年2月15日7:10660。
doi:10.1038/ncomms10660。

短G1期对小鼠胚胎干细胞施加结构性复制应力和叉重塑

Akshay K Ahuja公司 1, 卡罗琳娜·乔德考斯卡 2, 费德里科·特洛尼 三, 安娜·H·比扎德 4, 拉尔夫·齐薇格 1, 拉奎尔·赫拉多尔 1, 萨格拉里奥·奥尔特加 5, 伊恩·迪·希克森 4, 马提亚斯·阿尔特迈耶 三, 胡安-门德斯 2, 马西莫·洛佩斯 1
附属公司

短G1期对小鼠胚胎干细胞施加结构性复制应力和叉重塑

Akshay K Ahuja公司等人。 国家公社. .

摘要

胚胎干细胞（ESCs）代表一种短暂的生物状态，在这种状态下，多能性与快速增殖相结合。ESCs表现出组成型活性DNA损伤反应（DDR），但其分子决定因素仍然难以捉摸。我们在培养的ESC和小鼠胚胎中显示，H2AX磷酸化依赖于共济失调毛细血管扩张和Rad3相关（ATR），并与ssDNA-结合蛋白RPA和RAD51的染色质负载有关。复制中间体的单分子分析显示大量ssDNA间隙积累、分叉速度降低和频繁的分叉反转。所有这些复制应激标记都不会损害有丝分裂过程，并在分化开始时迅速消失。延迟ESCs的G1/S转变可形成53BP1核体，并抑制ssDNA积累、分叉减慢和随后S期的逆转。叉减慢和反转的基因失活导致未扰动ESCs的染色体断裂。我们认为，快速的细胞周期进程使ESC依赖有效的复制耦合机制来保护基因组完整性。

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数字

图1
图1。存在复制压力标记在体外在ESCs和体内在ICM单元中。
(一)胚胎干细胞（ESC）集落和部分分化ESC的免疫荧光（IF）染色(电子稳定控制系统-d; 干细胞标记物Oct4、DNA损伤标记物γH2AX和染色质结合的ssDNA-结合蛋白RPA32和RAD51。比例尺，25μm。(b条)FACS分析ESC和ESC-d中EdU掺入和DNA含量（DAPI）。显示不同细胞周期阶段的细胞百分比。(c（c）)ESC和ESC-d中显示的双重IF-染色的量化。每次双重染色至少对150个细胞进行评分。(d日)E3.5胚泡的γH2AX、RPA32和RAD51的IF染色。每次染色分析的胚胎数量分别为12个、11个和9个。图中显示了具有代表性的图像（另请参见补充图2和3）。比例尺，25μm。(e（电子）)对ESC、ESC-d和小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）进行生化分离后，对指示蛋白进行免疫印迹检测。细胞溶质激酶MEK2和染色质结合H3作为分离控制。以高分辨率扫描原始胶片，并用ImageJ定量免疫印迹信号的强度。C、 染色质富集组分；S、 可溶性部分（包括胞浆和丰富的核可溶性蛋白）；W、 全细胞提取物。直方图表示RPA32（左）和RAD51（右）的染色质/可溶性（C/S）比率。(（f）)在模拟、ATM抑制剂（ATMi）或ATR抑制剂（ATRi）治疗中，基于FACS的ESCsγH2AX染色定量。所有这些实验都是重复进行的。a.u.，任意单位。
图2
图2。ESCs显示ssDNA缺口大量积累，分叉速度降低，分叉反转频繁。
(一,c（c）)ESCs代表性复制叉的电子显微照片，显示双亲（P）和子（D）双工。白色箭头表示ssDNA缺口；黑色箭头指向倒转叉的倒退臂（R）。插图：(一)，一个放大的ssDNA缺口；(c（c）)，倒转分叉处的四通接头。比例尺，500 bp（=217 nm），插入200 bp。(b条)从ESCs中分离出的复制叉的频率，并用指定数量的ssDNA缺口来区分ESCs（ESC-d）。(d日)从ESC和ESC-d分离出的反向复制分支的频率。所分析的复制中间产物的数量在括号中表示。在一个独立的实验中也得到了类似的结果。(e（电子）)ESC、ESC-d和MEF的DNA纤维扩散。含CldU/IdU的小束分别用红色和绿色进行免疫染色。显示了ESC和“Differ”的两种代表性光纤。电子稳定控制系统。使用Mann-Whitney检验计算IdU复制轨道长度。
图3
图3。延迟G1/S而不是G2/M转换抑制ESCs中H2AX磷酸化。
(一)对ESCs中所示处理的Oct4和γH2AX进行FACS分析。PLK1i（BI-6727）和CDK1i（RO-3306）治疗延迟G2/M的进展，而CDK4/6i（LY-2835219）和CDC7i（PHA-767491）治疗延迟S期进入。左上象限确定干细胞的亚群（10月4日+)γH2AX染色阴性。(b条)学生的t吨-Oct4亚群测试+γH2AX−中标识的单元格（红色）一，通过三个独立的实验。误差线表示s.d**P（P）<0.005, ***P（P）<0.0005. (c（c）)细胞周期分布，通过基于FACS的DNA含量（DAPI）评估一。总人口以灰色显示，10月4日的子人口+γH2AX−红色。如有，10月4日+γH2AX−细胞总是在G1中被检测到。(d日——（f）)未经处理（UNT）和蚜虫灵（APH）处理的MEF和ESC显示不同有丝分裂缺陷的代表性图像和图形分布(d日染色质桥；e（电子）微核；（f），超细桥梁）。比例尺，10μm。直方图显示了三个独立实验的平均值和标准偏差。
图4
图4。缩短的G1期损害53BP1核体的形成，并在随后的S期引起复制应激。
(一)用EdU和53BP1染色的ESC和ESC-d的典型IF图像。ESC分化可检测到EdU阴性细胞中53BP1核信号增加。比例尺，25μm。(b条)通过软件辅助分割和特征提取，对ESC和ESC-d非同步群体中G1核（通过低DAPI和低EdU信号识别）中显微可辨别的53BP1核体（NB）进行量化（补充图6f）。在另外两个独立的实验中观察到了类似的结果。(c（c）)siRNA转染96 h后，Western blot分析模拟缺失（siLuc）和FZR1缺失（siFZR1）MEF中的FZR1-水平。TFIIH用作加载控制。(d日)在模拟和FZR1缺失的MEF异步群体的G1核中特异性地在显微镜下可辨别的53BP1 NB被量化，如b条. (b条,d日) **P（P）<0.005时***P（P）<0.0005（曼-惠特尼试验）(e（电子）)模拟缺失和FZR1缺失MEF中DNA合成（EdU掺入）、DNA含量（DAPI）和DDR活化（γH2AX）的FACS分析。图中显示了两个人群中EdU合并与DAPI的对比。γH2AX阳性细胞用红色表示。G1期和S期的细胞群也用红色表示。(（f）)DNA纤维分析评估模拟缺失和FZR1缺失MEF中的分叉进展。使用Mann-Whitney检验计算IdU复制轨道长度。(克,小时)基于EM的含有ssDNA间隙的复制中间体百分比评估(克)以及倒叉的百分比(小时)在从模拟缺失和FZR1缺失MEF提取的基因组DNA中。
图5
图5。ESCs G1期延长抑制了随后S期的复制应激。
(一)FACS分析对照ESCs、经CDC7i治疗的ESCs和从短暂CDC7l停搏释放的ESCs中的EdU掺入和DNA含量（DAPI）（PHA-767491，10μM，8 h）。定量分析早期S期细胞门控（红色）亚群的γH2AX染色（a.u.，任意单位）。(b条)IdU复制的轨迹长度，使用Mann-Whitney测试计算，用于控制ESC和短暂CDC7i阻滞释放的细胞。(c（c）)从对照ESC中分离出来的复制分叉的频率以及从短暂的CDC7i阻滞中释放出来的频率，显示ssDNA缺口的指示数量。(d日)与控制ESC隔离的反向复制分支的频率以及从短暂CDC7i停跳释放时的频率。
图6
图6。PARP和Rad51对于ESC中的复制分叉保护至关重要。
(一,d日)模拟处理ESCs和Olaparib处理ESCs的DNA纤维分析(一)、模拟转染的ESCs和转染siRad51的ESCs 48和72小时(d日). 图表显示了IdU复制轨迹长度的统计分析。(b条,e（电子）)从模拟处理的ESC和用Olaparib处理的ESCs中分离出的反向复制分支的频率(b条)、模拟转染的ESCs和转染siRad51的ESCs 48和72小时(e（电子）). (c（c）,（f）)脉冲场凝胶电泳（PFGE）评估模拟处理的ESCs、Olaparib处理的ESC中DNA双链断裂（DSB）的累积(c（c）)，模拟转染的ESCs和用siRad51转染48和72小时的ESCs(（f）). 如凝胶旁边所示，等于或大于500 Mb的DSB压缩成一条带，小于500 Mb DSB可作为涂片检测。对来自三个独立实验的DSB（带+涂片）强度进行量化并绘制。
图7
图7。描述ESCs和增殖体细胞基因组稳定性差异控制的模型。
在ESC和体细胞的每个S期结束时，不可避免地会出现重复不足区域和残留DNA损伤。然而，由于短暂的间隙期，ESC在随后的S期引导大量这些损伤，并通过广泛的分叉反转和复制耦合修复来保护基因组的完整性。相反，分化细胞具有延长的间隙期，组装53BP1 NB，并在进入S期之前修复大部分损伤（另请参见补充图7d）。
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引用人

  • 人类和兽医中的表观遗传和基因治疗。
    BártováE。 BártováE。 环境表观。2024年5月10日；10（1）：dvae006。doi:10.1093/eep/dvae006。eCollection 2024年。 环境Epigenet。2024 PMID：38751572 免费PMC文章。 审查。
  • 转录因子在有丝分裂恢复转录中的动态作用。
    Budzyñski MA、Wong AKL、Faghihi A、Teves SS。 Budzyñski MA等人。 生物化学Soc Trans。2024年4月24日；52(2):821-830. doi:10.1042/BST20231022。 生物化学Soc Trans。2024 PMID：38526206 免费PMC文章。 审查。
  • 着床前胚胎染色体嵌合体的机制及其对胚胎发育的影响。
    Zhang X，Zheng PS。 张X等。 J辅助生殖遗传学。2024年5月；41(5):1127-1141. doi:10.1007/s10815-024-03048-2。Epub 2024年2月22日。 J辅助生殖遗传学。2024 PMID：38386118 审查。
  • RAD51限制来自再激活来源的DNA过度复制。
    穆尼奥斯（Muñoz S）、布兰科·罗梅罗（Blanco-Romero E）、冈萨雷斯-阿科斯塔（González-Acosta D）、罗德里格斯-阿塞贝斯（Rodriguez-Acebes S）、梅吉亚斯（Megías D）、洛佩斯（Lopes M）、。 穆尼奥斯·S等人。 EMBO J.2024年3月；43(6):1043-1064. doi:10.1038/s44318-024-00038-z。电子出版2024年2月15日。 EMBO J.2024。 PMID：38360996 免费PMC文章。
  • γH2AX在复制应激诱导致癌中的作用：可能的联系和最新进展。
    Fragkos M、Choleza M、Papadopoulou P。 Fragkos M等人。 癌症诊断进展。2023年11月3日；3(6):639-648. doi:10.21873/cdp.10266。电子收款2023年11月-12月。 癌症诊断进展。2023 PMID：37927801 免费PMC文章。 审查。
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工具书类

    1. Lanner F.早期小鼠胚胎的世系规范。实验单元。第321号决议，第32-39号决议（2014年）。-公共医学
    1. Aladjem M.I.等人。ES细胞不激活p53依赖性应激反应，并在DNA损伤时发生p53依赖的凋亡。货币。《生物学》8，145–155（1998）。-公共医学
    1. Hong Y.和Stambrook P.J.电离辐射后胚胎干细胞中G1缺失阻滞的恢复和凋亡保护。程序。美国国家科学院。科学。美国10114443–14448（2004）。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Tichy E.D.和Stambrook P.J.小鼠胚胎干细胞和分化细胞的DNA修复。实验单元。第3141929-1936号决议（2008年）。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. van der Laan S.、Tsanov N.、Crozet C.和Maiorano D.小鼠ESC中Dub3的高表达将G1/S检查点与多能性结合。分子细胞。52366–379（2013年）。-公共医学

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