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.2013;8（3）：e59888。
doi:10.1371/journal.pone.0059888。 Epub 2013年3月28日。

白藜芦醇通过调节SIRT1-ROCK1信号通路抑制β-淀粉样蛋白诱导的神经元凋亡

冯晓文 1, 南梁（Nan Liang）, 朱德晓, 青高, 雷鹏, 董海曼, 青味悦, 刘海丽（Haili Liu）, 李华宝, 张静（音译）, 景浩, 英茂高, 余雪杰, 孙金浩
附属公司

白藜芦醇通过调节SIRT1-ROCK1信号通路抑制β-淀粉样蛋白诱导的神经元凋亡

冯晓文等。 公共科学图书馆综合版. 2013.

摘要

阿尔茨海默病（AD）的特征是β淀粉样肽（Aβ）的积累和神经元的丢失。最近，越来越多的证据表明，白藜芦醇作为一种天然来源于葡萄的草本化合物，可以调节AD的病理生理，但其机制尚不清楚。因此，本研究旨在研究白藜芦醇对β淀粉样肽25-35（Aβ（25-35））神经毒性的保护作用，并进一步探讨其潜在机制。用Aβ（25-35）损伤PC12细胞，在培养基中加入不同浓度的白藜芦醇。我们通过3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四氮唑（MTT）和乳酸脱氢酶（LDH）比色测定观察到白藜芦醇增加了细胞活力。流式细胞术显示白藜芦醇可减少细胞凋亡。此外，白藜芦醇还稳定了细胞间Ca（2+）的稳态，并减轻了Aβ（25-35）的神经毒性。此外，白藜芦醇显著逆转了Aβ（25-35）抑制的沉默信息调节器1（SIRT1）活性，导致Rho-associated kinase 1（ROCK1）下调。我们的结果清楚地表明，白藜芦醇通过上调SIRT1显著保护PC12细胞并抑制β淀粉样蛋白诱导的细胞凋亡。此外，作为下游信号分子，ROCK1受到SIRT1的负调控。综上所述，我们的研究表明SIRT1-ROCK1通路在AD的发病机制中起着关键作用。

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竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。PC12细胞暴露于Aβ后的存活率25–35.
用10、20和40µM Aβ培养PC12细胞24和48小时25–35分别是。24小时后在体外培养，（A）正常对照组PC12细胞生长良好，突起较长。（B） 与10µM Aβ孵育时25–35，细胞轴突逐渐收缩。（C） 添加20µM Aβ时25–35培养基中细胞损伤明显，出现细胞碎片。（D） 40µM Aβ25–35严重损伤细胞导致更多细胞丢失。使用Aβ48小时后25–35更多的细胞漂浮在培养基中，细胞碎片增加。箭头指示细胞碎片。通过MTT法评估细胞活力。吸光度值表示为平均值±S.E.M**第页培养24h时与正常对照组比较，p<0.01；## 第页培养48h时与正常对照组比较，p<0.01。数据通过双向方差分析进行处理，然后进行纽曼-凯尔斯检验（n====================================================================================9). 比例尺：A-D，100µm。
图2
图2。白藜芦醇对PC12细胞抗Aβ的保护作用25–35.
PC12细胞在添加12.5（A）、25（B）、50（C）和100µM（D）白藜芦醇的DMEM培养基中培养，然后添加20µM Aβ25–35.E-H分别是A-D的放大倍数。（A） 在12.5µM白藜芦醇保护组中，许多细胞漂浮并消失。在25（B）和100（D）µM白藜芦醇组中，尽管细胞生长有突起，但一些细胞肿胀并呈圆形。然而，50µM（C）白藜芦醇促进了神经突起的生长，细胞碎片较少。箭头（E、F和H）表示细胞碎片。星号（G）表示神经突起。箭头（F）表示弯曲的神经突。通过MTT（I）和LDH（J）分析进一步测定细胞活力。吸光度值记录为平均值±S.E.M*第页与Aβ相比<0.0125–35损伤组；# 第页与24小时组和48小时组12.5、25和100µM白藜芦醇的值相比，<0.01。数据通过双向方差分析进行处理，然后进行纽曼-凯尔斯检验（n====================================================================================9). 比例尺：A–D，100µm；E、 30微米；F、 30微米；G、 15微米；和H，20µm。
图3
图3。细胞内钙的变化2+级别。
荧光钙2+使用fluo-3/AM指示剂测定[Ca2+]i级。只有少数PC12细胞负载Ca2+正常对照组（A）显示绿色荧光。用20µM Aβ处理后25–3524小时在体外，许多细胞呈亮绿色，荧光强度高（B）。当添加50µM白藜芦醇时，PC12细胞负载Ca2+指标下降（C）。统计分析表明，白藜芦醇保护组的荧光强度显著低于Aβ25–35损伤组仍高于正常对照组（D）。荧光强度值表示为平均值±S.E.M**第页与Aβ相比<0.0125–35学生伤害组t吨-测试（n====================================================================================9). 使用蔡司LSM 780激光共聚焦显微镜以200倍放大率拍摄A–C图像。比例尺：A–C，100µm。
图4
图4。白藜芦醇对Aβ的影响25–35-诱导细胞凋亡。
Aβ的PC12细胞25–35损伤组（A–C）、白藜芦醇保护组（D–F）和正常对照组（G–I）均用Hoechst 33342（蓝色）和PI（红色）染色。C、 F和I是相应染色的合并图片。在荧光显微镜下，凋亡细胞的细胞核被鲜红色的碎裂细胞核染色，其中含有一个或多个浓缩染色质裂片（C、F和I中的箭头）。存活细胞用明亮的蓝色荧光染色（C、F和I中的星号）。J、 K和L是30µM Aβ流式细胞术的结果25–35，50µM白藜芦醇，和正常对照组。左下象限区域显示存活细胞。早期和晚期凋亡细胞分别显示在右下象限和右上象限。统计分析表明，与Aβ相比，白藜芦醇显著降低早期和晚期细胞凋亡25–35学生伤害组t吨-测试(第页<0.01，牛顿====================================================================================6). A–I的照片是用蔡司LSM 780激光共聚焦显微镜以200倍放大率拍摄的。比例尺：A–I，100µm。
图5
图5。白藜芦醇挽救了SIRT1和ROCK1的表达。
通过Western blotting（A）和实时定量PCR（B和C）检测SIRT1和ROCK1的表达。20µM Aβ25–35显著降低SIRT1蛋白（D）和mRNA（F）的表达，但显著增加ROCK1蛋白（E）和mRNA（G）的表达。在培养基中加入50µM白藜芦醇，SIRT1和ROCK1的表达部分恢复。在实时定量PCR（B和C）中，磅呈现GAPDH；星号表示正常对照组；箭头表示白藜芦醇保护组；箭头表示Aβ25–35损伤组**第页与Aβ相比<0.0125–35损伤组；## 第页与正常对照组相比，学生的t吨-测试（n====================================================================================3).
图6
图6。SIRT1抑制剂烟酰胺部分减弱白藜芦醇对Aβ的保护作用25–35.
为了进一步确定SIRT1在白藜芦醇保护PC12细胞中的作用，在白藜醇保护组的培养基中添加烟酰胺。在相差显微镜（A–C）下观察PC12细胞的生长，用Hoechst 33342（蓝色）和PI（红色）双重染色（D–F）检测细胞凋亡，并在蔡司LSM 780激光共聚焦显微镜下观察细胞凋亡。烟酰胺（C和F）减弱了白藜芦醇（B和E）对PC12细胞的保护作用。A和D是Aβ25–35损伤组。进行MTT分析（G）和细胞凋亡分析（H）。数据以平均值±标准误差表示**第页与Aβ相比<0.0125–35损伤组；## 第页与Student’s的烟酰胺组相比，<0.01t吨-测试（n====================================================================================9). 比例尺：A-C，50µm；D-F，50µm。
图7
图7。烟酰胺抑制SIRT1表达并激活ROCK1表达。
通过Western blotting（A）和实时定量PCR（B和C）检测SIRT1和ROCK1的表达。烟酰胺显著抑制SIRT1蛋白（D）和mRNA（F）的表达，但增加ROCK1蛋白（E）和mRNA（G）的表达。Y-27632显著抑制ROCK1蛋白（D）和mRNA（F）的表达，但不影响SIRT1蛋白（E）和mRNA（G）的表达。在实时定量PCR（B和C）中，磅呈现GAPDH;星号表示烟酰胺组；箭头为Y-27632组；arrow为正常对照组**第页<0.01和## 第页<0.01，与正常对照组相比t吨-测试（n====================================================================================3).
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赠款和资金

这项工作得到了国家自然科学基金（No.81071081）、山东省自然科学基金资助（ZR2010HM051和ZR2012HM026）和山东省科技发展计划（2011GSF11810）的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

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