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.2011年7月1日；22(13):2290-300.
doi:10.1091/mbc。E10-11-0893。 Epub 2011年4月27日。

在对沙门氏菌的自噬反应中，LC3募集机制与Atg9L1依赖性膜的形成是分开的

顺山（Shun Kageyama） 1, 大森宏子, Tatsuya Saitoh公司, Takefumi Sone公司, 关俊林, 石佐·阿基拉（Shizuo Akira）, 福米奥·伊马莫托, 野田毅, 吉森田松（Tamotsu Yoshimori）
附属公司

在对沙门氏菌的自噬反应中，LC3募集机制与Atg9L1依赖性膜的形成是分开的

顺山（Shun Kageyama）等。 分子生物学细胞. .

摘要

沙门氏菌在上皮细胞中发展为常驻细菌，自噬机制（Atg）被认为在这一过程中起着重要作用。在本文中，我们发现沙门氏菌周围有一种类似自噬体的双层膜结构，该结构仍然存在于沙门氏杆菌空泡（SCV）中。这种双膜在200 kDa（FIP200）缺陷细胞的Atg9L1和FAK家族相互作用蛋白中有缺陷。Atg9L1和FIP200对于磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）复合物的自噬特异性补充很重要。然而，在缺乏Atg9L1、FIP200和PI3K复合物、LC3及其E3样酶、Atg16L复合物的情况下，沙门氏菌仍会被招募。我们建议通过独立于隔离膜生成的机制来招募LC3系统。

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数字

图1：
图1：
GFP-LC3与感染的相关性鼠伤寒沙门氏菌（A）稳定表达GFP-LC3的MEF感染鼠伤寒沙门氏菌表达mCherry 5分钟，然后清洗以去除接种物。使用荧光倒置显微镜每隔～15秒对细胞成像。显示了活细胞成像，并显示了GFP-LC3结合后的消逝时间。比例尺：1μm。（B和C）每一个已知Atg基因缺失的MEF及其稳定表达GFP-LC3的亲代细胞被感染鼠伤寒沙门氏菌在MOI为10的条件下表达mCherry 1小时，然后清洗。固定样品，用荧光显微镜检查GFP-LC3结合率。三个独立实验的平均±标准偏差为100个细菌。比例尺：2μm。（D−I）注意到的Atg KOs及其亲代细胞或NIH3T3细胞（含或不含Atg4B）的MEFC74A号表达被感染鼠伤寒沙门氏菌在不含抗生素的DMEM中以100的MOI维持10分钟。感染后，清洗细胞以清除细胞外液鼠伤寒沙门氏菌并在含有庆大霉素的DMEM中孵育6 h。将细胞裂解物置于LB板上，并在37℃孵育1 d后计算菌落数。显示了三个独立实验的平均±SD。
图2：
图2：
GFP-LC3与沙门氏菌（A）稳定表达GFP-LC3的野生型或Atg9L1 KO MEF感染鼠伤寒沙门氏菌在100的MOI下表达mCherry 5分钟，清洗，然后培养1小时。一个GFP-LC3阳性鼠伤寒沙门氏菌然后每隔4分钟用MetaMorph自动追踪系统进行延时成像，直到感染后6小时。显示经过的时间。比例尺：20μm。（B） 最终数量鼠伤寒沙门氏菌在延时成像6小时后测定每个细胞中的蛋白质，并按指示分组。（C） 稳定表达GFP-LC3的细胞被感染鼠伤寒沙门氏菌表达mCherry并孵化。将细胞固定在指定的时间点，并通过荧光显微镜进行检查。每个实验至少统计100个细胞。三个独立实验的平均值为±SD。
图3：
图3：
Atg9L1定位的活细胞成像。稳定表达Atg9L1-GFP的（A和C）MEF感染鼠伤寒沙门氏菌表达mCherry 5分钟。然后用荧光倒置显微镜清洗细胞，每隔～3秒拍摄4分钟或每隔～50秒拍摄28分钟。显示经过的时间。比例尺：5μm（A）或1μm（C）。（B） 稳定表达Atg9L1-GFP的MEF被固定，并用抗EEA1抗体进行免疫染色。比例尺：20μm。（D） 稳定表达Atg9L1-SECFP和EYFP-LC3的MEF感染鼠伤寒沙门氏菌在100的MOI下表达mCherry 5分钟，并像（A）和（C）中那样以约30-s的间隔拍摄图像10分钟。比例尺：1μm。
图4：
图4：
Atg蛋白在Atg9L1 KO细胞中的定位。Atg9L1 KO MEF和稳定表达GFP-Atg5（A）、GFP-Atg 14L（B）、GFP-WIPI-1（C）或ULK1-GFP（D）的亲本野生型细胞被感染鼠伤寒沙门氏菌表达mCherry 1小时。固定后，拍摄图像。测定了每种情况下Atg阳性细菌的数量，并显示了每种细菌的百分比。三个独立实验的平均±标准偏差为100个细菌。比例尺：20μm。
图5：
图5：
沃特曼对每个Atg蛋白与鼠伤寒沙门氏菌在感染前用100 nM沃特曼菌素处理稳定表达GFP-LC3（A）、GFP-Atg5（B）或GFP-WIPI-1（C）的MEF 15分钟。这些细胞被感染了鼠伤寒沙门氏菌在MOI为40的条件下保持30分钟，清洗、固定，然后用抗EEA1抗体进行免疫染色，并用Hoechst 33342进行染色。比例尺：2μm。稳定表达GFP-LC3的（D，E）MEF感染鼠伤寒沙门氏菌在MOI为10的条件下表达mCherry 1小时，然后清洗。固定样品，用荧光显微镜检查GFP-LC3结合率。至少统计了100个细菌。比例尺：2μm。
图6：
图6：
EYFP-LC3−相关膜的CLEM分析。将稳定表达EYFP-LC3的野生型（A和B）或Atg9L1 KO MEF（C和D）培养在网格玻璃底培养皿上，然后感染鼠伤寒沙门氏菌30分钟。细胞固定并用Hoechst 33342染色。GFP-LC3−正极鼠伤寒沙门氏菌用共焦激光扫描显微镜观察。对相同的样品进行了进一步的电子显微镜检查。电子显微照片是在与透射电子显微镜相同的样品场中拍摄的。白色比例尺：20μm；黑色刻度条：500纳米。（E） 量化周围单个或多个膜的数量鼠伤寒沙门氏菌野生型或Atg9L1 KO MEF。
图7：
图7：
Atg蛋白与鼠伤寒沙门氏菌在FIP200 KO MEF中。野生型或FIP200 KO MEF稳定表达GFP-LC3（A）、GFP-Atg5（B）、GFP-Atg14L（C）、GFP WIPI-1（D）、Atg9L1-GFP（E）或ULK1-GFP鼠伤寒沙门氏菌表达mCherry 1 h。固定并观察细胞。（G） 与Atg蛋白相关的细菌百分比通过荧光显微镜测定。至少有三个独立实验的平均±SD，其中至少检测了100个细菌。比例尺：20μm。
图8：
图8：
Atg蛋白动力学模型沙门氏菌排他性。Atg14L、ULK1和Atg9L1在膜形成位置附近循环鼠伤寒沙门氏菌和另一个蜂窝池。往返于膜形成部位的循环需要指示的Atg蛋白。鼠伤寒沙门氏菌提供了未知的招募因子（X），Atg16L1复合体可能在SCV附近招募。独立于LC3形成的隔离膜可能是LC3脂质化的较好靶点。在Atg9L1 KO MEFs中，不形成隔离膜，SCV是LC3脂质化的目标。即使没有LC3系统，也会形成不完整的隔离膜。
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