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.2010年8月6日；285(32):24466-76.
doi:10.1074/jbc。M10.109801。 Epub 2010年6月1日。

新型人PP1磷酸酶复合物的鉴定与表征

Jeong-Heon Lee（李正勋） 1, Jinsam You公司, 埃里卡·多布罗塔, 大卫·G·斯卡尔尼克
附属公司

新型人PP1磷酸酶复合物的鉴定与表征

Jeong-Heon Lee（李正勋）等。 生物化学杂志. .

摘要

哺乳动物Wdr82是Setd1a和Setd1b组蛋白H3-赖氨酸4甲基转移酶复合物的调节成分，与Setd1复合物与活性基因转录起始位点的连接有关。在本文报道的研究中，免疫沉淀和质谱分析显示，Wdr82还与多种蛋白复合物相关，包括一个RNA聚合酶II复合物、四个不同的组蛋白H3-Lys（4）甲基转移酶复合物、蛋白磷酸酶1（PP1）相关蛋白、一个含伴侣蛋白的Tcp1复合物、，和其他没有特征的蛋白质。PP1-相关蛋白的进一步表征确定了一个稳定的多聚物复合体，由调节亚基PNUTS、Tox4和Wdr82和PP1催化亚基组成（表示为PTW/PP1磷酸酶复合体）。PTW/PP1复合物以PP1依赖的方式表现出体外磷酸酶活性。蛋白质相互作用分析表明，PNUTS通过为每个成分提供结合平台来调节磷酸酶复合物的形成。PNUTS和Tox4亚单位主要与HEK293细胞中的PTW/PP1磷酸酶复合物相关，并且该复合物的完整性在整个细胞周期过程中保持不变。在HEK293细胞中，PP1相互作用缺陷型PNUTS（W401A）的诱导表达或小干扰RNA介导的PNUTS耗竭会导致有丝分裂出口的细胞周期阻滞和凋亡细胞死亡。PNUTS（W401A）显示与染色体的正常结合，但在末期染色体解凝聚过程中会导致缺陷。这些数据揭示了哺乳动物Wdr82在多种细胞过程中发挥作用，并揭示了PTW/PP1磷酸酶复合体在从有丝分裂过渡到间期期间调节染色质结构的潜在作用。

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数字

图1。
图1。
Wdr82与多种蛋白复合物有关。 A类用1μg/ml多西环素诱导表达FLAG-Wdr82或空载体的T-REx HEK293稳定细胞株3天。制备核提取物并进行FLAG免疫沉淀(IP标志)经大量洗涤后，用FLAG肽洗脱结合蛋白。蛋白质经SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝染色。切除蛋白质带并进行凝胶内胰蛋白酶消化。用四极杆飞行时间质谱分析肽，并鉴定蛋白质。B类根据已知的生物活性，将鉴定的蛋白质分为五类。C类用1μg/ml多西环素诱导表达FLAG-Wdr82或空载体的T-REx HEK293稳定细胞株3天。核提取物进行FLAG免疫沉淀，免疫沉淀通过Western blotting分析每个复合类的代表性蛋白质。
图2。
图2。
Wdr82与PP1催化和调节亚单位形成复合物。 A类内源性PNUTS和Tox4与PP1和Wdr82相关。对从HEK293细胞中分离的核提取物进行免疫沉淀(IP（IP）)使用针对Tox4、PNUTS、Setd1a或Setd1b的抗血清。使用所示抗血清通过Western blotting分析免疫沉淀物。B类，PNUTS、Tox4、Wdr82和PP1催化亚基表现出相互免疫沉淀。用1μg/ml多西环素诱导表达空载体或所示FLAG标记蛋白的可诱导T-REx HEK293稳定细胞系3天。对核提取物进行FLAG免疫沉淀，并使用指示的抗血清通过蛋白质印迹分析免疫沉淀。星号在FLAG Western blot中显示每个FLAG标记蛋白的预期大小。C类蔗糖梯度分馏后，PNUTS、Tox4、Wdr82和PP1催化亚基共同迁移。用1μg/ml多西环素诱导表达FLAG-Wdr82的T-REx HEK293细胞3天。制备核提取物并进行FLAG免疫沉淀，用FLAG肽洗脱结合蛋白。如前所述，将Wdr82相关蛋白加载到10–50%蔗糖梯度上，并通过平衡离心进行分析（32）。用Western blotting分析各组分的等体积。RNA pol II亚单位、组蛋白甲基转移酶复合物成分和PP1-相关蛋白（如PNUTS、Tox4和PP1催化亚单位）的迁移如梯度所示。分子标记应用于平行梯度。D类蔗糖梯度分馏分析后，内源性PNUTS、Tox4和Wdr82共同迁移。将HEK293细胞的核提取物加载到10–50%蔗糖梯度上，并通过平衡离心进行分析。收集组分，并使用所示抗血清通过Western blotting分析等体积的每个组分。
图3。
图3。
PNUTS和Tox4几乎只与PTW/PP1磷酸酶复合物的成分相互作用。 A类，通过质谱鉴定PNUTS和Tox4相关蛋白。用1μg/ml多西环素诱导表达FLAG-PNUTS、FLAG-Tox4或空载体的可诱导T-REx HEK293稳定细胞系3天。制备核提取物并进行FLAG免疫沉淀，经大量洗涤后用FLAG肽洗脱结合蛋白。蛋白质用SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝染色。用质谱法分析特定谱带。这个箭头表示已识别的蛋白质。B类，PTW/PP1磷酸酶复合物概述。图示PTW/PP1磷酸酶复合物中每个成分的结构域。TFS2N公司，转录因子II N末端结构域；RVXF图案，PP1对接图案；锌指;HMG盒、高移动性分组盒；PP2Ac（PP2Ac），蛋白磷酸酶2A的催化结构域；第40页，重复WD40。每种成分中的氨基酸数量已标明。
图4。
图4。
PNUTS通过为每个成分提供结合平台来介导PTW/PP1复合物的形成。 A类，PNUTS直接与Wdr82相互作用，并介导Wdr82与PP1α的关联。从昆虫中纯化重组FLAG-Wdr82、His-PNUTS和His-Tox4第9部分细胞，并从中纯化GST-PP1α大肠杆菌纯化的FLAG-Wdr82与各种纯化成分组合孵育，通过在体外FLAG下拉分析。蛋白质用SDS-PAGE分离，考马斯亮蓝染色检测。这个箭头表明蛋白质带的特性。B类，PNUTS直接与PP1α相互作用，并介导PP1α与Wdr82的关联。纯化的GST-PP1α与各种纯化成分组合孵育，通过在体外GST下拉分析。蛋白质分析如上所述。C类，PTW/PP1磷酸酶复合体内的蛋白质相互作用。图中显示了PNUTS删除结构。这个数字表示PNUTS蛋白质的氨基酸残基。用带有N末端FLAG表位的PNUTS缺失结构瞬时转染HEK293细胞。制备核提取物并进行FLAG免疫沉淀(IP标志)，并使用所示抗血清通过Western blotting分析免疫沉淀物。D类，PTW/PP1磷酸酶复合体内蛋白质相互作用概述。
图5。
图5。
PTW/PP1复合物具有磷酸酶活性在体外.使用FLAG免疫沉淀法从可诱导的T-REx HEK293细胞系中纯化Wdr82-、PNUTS-和PP1α相关蛋白。用MAPK磷酸化的GST-CTD作为底物，在磷酸酶试验中检测纯化的蛋白质。体外磷酸化GST-CTD与来自载体控制、Wdr82、PNUTS或PP1α的免疫沉淀物在30°C下在没有或存在PP1-特异性抑制剂NIPP1或抑制剂2的情况下孵育1小时。反应产物通过Western blotting使用抗Ser（P）进行分析5(反Ser5P)CTD和抗PP1α抗血清。抗血清（P）5CTD抗血清在血清中识别磷酸化的CTD5MAPK反应的主要产物（34）。PP1在PP1免疫沉淀物中的移动性稍慢是由于FLAG表位的存在。
图6。
图6。
PTW/PP1复合体在整个细胞周期进程中的染色质缔合和完整性。 A类PNUTS的染色质关联在整个细胞周期进程中受到调节。将表达FLAG-PNUTS的可诱导T-REx HEK293细胞在玻璃底胶原包被的培养皿上培养，并用1μg/ml多西环素诱导2天。用抗FLAG抗体和异硫氰酸荧光素（FITC）结合二级抗体对细胞进行染色。DNA经DAPI染色后，用共焦显微镜观察细胞。根据细胞形态和DAPI染色确定细胞相。B类PTW/PP1磷酸酶复合物与染色质相关。如前所述，通过连续提取分离HEK293细胞（42）。通过Western blotting分析每个组分的相等比例。乙酰化组蛋白H3和NuMA分别用作染色质和基质组分的标记蛋白。C类，PTW/PP1磷酸酶复合物的完整性在整个细胞周期过程中保持不变。通过连续的胸腺嘧啶-诺卡唑阻滞诱导并同步表达FLAG-PNUTS的T-REx HEK293细胞。在释放后的不同时间点采集细胞。通过PI染色和流式细胞术分析每个时间点的小部分细胞的细胞周期分布。制备全细胞提取物并进行FLAG免疫沉淀(IP标志)，并使用所示抗血清通过Western blotting分析免疫沉淀物。
图7。
图7。
PTW/PP1磷酸酶复合物的失调会导致细胞周期停滞和细胞死亡。 A类，PNUTS（W401A）突变体与Wdr82和Tox4相互作用，但不与PP1相互作用。用1μg/ml多西环素诱导表达FLAG-PNUTS、FLAG-PNUTS（W401A）或空载体的T-REx HEK293细胞株3天。核提取物进行FLAG免疫沉淀，免疫沉淀通过Western blotting进行分析。B类PNUTS（W401A）的诱导表达导致增殖缺陷。在1μg/ml多西环素存在下培养表达空载体、FLAG-PNUTS或FLAG-PNUTS（W401A）的T-REx HEK293细胞株3天。用倒置显微镜拍摄细胞形态。显示了具有代表性的图像。C类PNUTS（W401A）的诱导表达导致细胞死亡。表达FLAG-PNUTS或FLAG-PNUTS（W401A）的T-REx HEK293细胞系在玻璃底胶原蛋白涂层培养皿中培养。用1μg/ml多西环素诱导细胞4.5天。细胞固定，DAPI染色，共聚焦显微镜观察。显示了具有代表性的图像。D类PNUTS（W401A）的诱导表达导致凋亡细胞死亡。表达空载体或FLAG-PNUTS（W401A）的T-REx HEK293细胞系在1μg/ml多西环素存在下培养3天。Annexin V和PI染色后用流式细胞仪检测凋亡细胞。欧洲联盟,右上面板对应死亡细胞；陆上通信线,左下面板对应于健康细胞；低压,右下面板对应于凋亡细胞。数值表示三个实验的数据摘要。*，第页< 0.05.E类PNUTS（W401A）的诱导表达导致细胞周期阻滞。表达空载体、FLAG-PNUTS或FLAG-PNUTS（W401A）的T-REx HEK293细胞系在没有或存在1μg/ml多西环素的情况下培养3天。通过PI染色和流式细胞术分析细胞周期分布。测定细胞周期每个阶段的细胞百分比。
图8。
图8。
PNUTS的耗尽导致PTW/PP1复合物的不稳定，导致细胞周期失调和凋亡细胞死亡。 A类PNUTS的耗尽导致PTW/PP1复合物的不稳定。根据制造商的说明，用对照或PNUTS siRNA池转染HEK293细胞。转染3天后通过Western blotting分析蛋白质。B类PNUTS缺失导致细胞周期分布异常。通过PI染色和流式细胞术分析转染3天后的细胞周期分布。这个误差线表示平均S.D.，以及第页值由标准确定t吨测试。C类PNUTS的缺失导致凋亡细胞死亡。转染3天后的凋亡细胞经Annexin V和PI染色后用细胞仪进行分析。欧洲联盟,右上面板对应死亡细胞；陆上通信线,左下面板对应健康细胞；低压,右下面板对应于凋亡细胞。数值表示三个实验的数据摘要。*，第页< 0.05.
图9。
图9。
PTW/PP1磷酸酶复合体的失调会导致有丝分裂出口的缺陷。表达GFP-PNUTS（W401A）的T-REx HEK293细胞在玻璃底胶原包被的培养皿上培养。细胞在1μg/ml多西环素存在下培养3天。将细胞固定并通过DAPI染色，并通过共聚焦显微镜进行观察。这个前三列表现出有丝分裂阶段的典型进展第四列显示了从有丝分裂到间期的缺陷出口的典型图像。
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