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.2008年4月4日；283(14):9177-86.
doi:10.1074/jbc。M707247200之间。 Epub 2008年2月7日。

Neph1是肾缝隔膜的组成部分，由Src家族酪氨酸激酶酪氨酸磷酸化，并通过结合Grb2调节细胞内信号传导

Yutaka Harita公司 1, 栗原秀武, 小坂秀太郎, 托鲁·特祖卡, Takashi Sekine公司, 井石隆志, 服部信介
附属公司

Neph1是肾缝隔膜的组成部分，由Src家族酪氨酸激酶酪氨酸磷酸化，并通过结合Grb2调节细胞内信号传导

Harita Yutaka Harita等。 生物化学杂志. .

摘要

有多种证据表明，足细胞缝隙隔膜（SD）作为肾小球滤过屏障的结构框架，也发挥着重要的信号平台作用。已知包括nephrin和TRPC6在内的几个SD成分被Src家族酪氨酸激酶（SFK）Fyn磷酸化。在这里，我们将另一种SD成分Neph1表征为SFK的新型底物。Fyn在体外和完整细胞中与Neph1的细胞质域相互作用并磷酸化。肽质量指纹图谱和定点突变鉴定了几个酪氨酸磷酸化位点。在使用大鼠肾小球裂解物的下拉分析中，Neph1（而非nephrin）以磷酸化依赖的方式与衔接蛋白Grb2和酪氨酸激酶Csk特异性结合。Neph1的酪氨酸637和638对Neph1-Grb2结合至关重要。酪氨酸637的磷酸化在足细胞损伤的体内模型中显著上调。此外，Neph1减弱Fyn诱导的ERK激活，这种抑制作用需要Grb2 SH2结构域的完整结合基序。我们的结果表明，Neph1是SFK的一种新型体内底物，并表明Neph1通过与Grb2的磷酸化依赖性相互作用调节ERK信号。因此，SFK通过酪氨酸磷酸化在SD协调广泛的蛋白质相互作用和细胞内信号网络。

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数字

图1。
图1。
用Neph1C抗体检测Neph1。 A类,分离的大鼠肾小球、未转染的293T细胞、293T淋巴细胞的裂解物用编码Neph1的质粒或对照载体瞬时转染用SDS-PAGE（10%）分离，转移到硝化纤维素中，并进行免疫印迹带抗Neph1C(左侧面板）或抗Neph1C预吸收免疫用肽(右侧面板).B类，裂解物来自用编码FLAG标记Neph1的质粒瞬时转染293T细胞，Neph2或nephrin通过抗FLAG抗体免疫沉淀，并且免疫沉淀用抗FLAG或抗Neph1C抗体进行免疫印迹。C类，间接免疫荧光显微镜检测Neph1在带有Neph1C抗体的成年大鼠肾脏冷冻切片中的表达。这个抗体特异性标记肾小球足细胞。
图2。
图2。
渗透汽化物处理后内源性Neph1的酪氨酸磷酸化培养的足细胞。 A、，经处理的培养足细胞裂解物有或没有1m米渗透汽化物免疫沉淀15min用Neph1C抗体，免疫沉淀用抗Neph1C或抗磷酸酪氨酸(对-Tyr)抗体。B类,如有指示，用5μ米SU6656用于60最小值或10μ米PP2处理15分钟，然后用渗透纳德处理。抗Neph1C免疫沉淀物(知识产权)被免疫印迹抗磷酸酪氨酸或抗Neph1C抗体。工作分解结构，蛋白质印迹。
图3。
图3。
Neph1与Src家族酪氨酸激酶结合并被磷酸化费恩。 A、，用所示质粒转染293T细胞对活动项进行编码(YF年)或不活动(KN（千牛）)Fyn的形式以及野生型Neph1。通过免疫印迹分析细胞裂解物抗Neph1C抗体或抗磷酸酪氨酸(对-Tyr)抗体。B、，将所示质粒转染293T细胞抗FLAG免疫沉淀物(知识产权)或通过以下方法分析细胞裂解物用所示抗体进行免疫印迹。C、，293T细胞转染Neph1-Flag以及非活性或活性形式Fyn的。通过以下方法分析抗-FLAG免疫沉淀物和细胞裂解物用所示抗体进行免疫印迹。D、，Fyn与Neph1绑定在体外GST或GST-标记的Neph1细胞质域（GST-Neph1CD；氨基酸585–755）固定在谷胱甘肽珠上，并且His-tagged Fyn磷酸化（活性形式）在体外.消费税用抗-His抗体对下拉菜单进行免疫印迹。工作分解结构，西部污点。
图4。
图4。
Fyn对Neph1的酪氨酸磷酸化在体外.A、，Neph1细胞质结构域与Fyn孵育或不孵育在体外，并对样品进行免疫印迹抗磷酸酪氨酸抗体。B、，酪氨酸残基的鉴定Fyn磷酸化的Neph1。与中相同的样本A类是用胰蛋白酶消化，用MALDI-TOF质量块分析肽光谱仪。观察到峰值强度有两次明显下降肽（表示为箭头; 970.5和1500.7 Da），中度另一肽（1198.5 Da，虚线箭头).C、，Neph1细胞质结构域中的酪氨酸磷酸化位点。氨基酸Neph1-细胞质结构域（585-755）的序列氨基末端连接器序列（用双下划线).970.5和1500.7 Da对应的肽为下划线的.A型对应于1198.5 Da的肽由虚线下划线候选磷酸化位点由箭头带有氨基酸数。赖氨酸和精氨酸残基是用标记单下划线.哥伦比亚广播公司考马斯亮丽蓝色；工作分解结构，Western blot。
图5。
图5。
Fyn磷酸化Neph1酪氨酸残基的鉴定LC-MS/MS分析。Fyn磷酸化的Neph1胞质结构域是用胰蛋白酶消化，然后离线分析肽nanoLC-MALDI-TOF/TOF分析。图中显示的结果显示Neph1在Tyr的酪氨酸磷酸化637和提尔638.
图6。
图6。
Neph1的几个酪氨酸残基完整磷酸化细胞。 A、，标记为FLAG的野生型(重量)或突变Neph1细胞质区与活性Fyn一起转染293T细胞。细胞裂解物被免疫沉淀(知识产权)具有抗FLAG抗体和免疫沉淀进行磷酸酪氨酸免疫印迹。作为控制，野生型Neph1在没有Fyn的情况下转染。B、，密度测定法A类如图所示。值被规范化为野生类型Neph1。
图7。
图7。
Grb2与磷酸化Neph1特异性结合。 A、，重组GST-Neph1CD与谷胱甘肽-脑葡萄糖珠结合，并且用含或不含ATP的重组Fyn培养。洗过之后，珠子与正常大鼠的肾小球裂解物和结合蛋白孵育通过免疫印迹分析Grb2和Csk。B、，Grb2绑定到293T细胞中磷酸化Neph1。293T细胞转染指示载体和抗FLAG免疫沉淀物(知识产权)和单元格用蛋白质印迹法分析裂解产物(工作分解结构)对于FLAG标签，磷酸酪氨酸和Grb2。C、，两个Tyr637和提尔638需要绑定到Grb2。FLAG标记的野生型或将所示突变体Neph1与Fyn一起转染293T细胞，Western分析了抗FLAG免疫沉淀物和细胞裂解物FLAG标签、磷酸酪氨酸和Grb2的印迹。
图8。
图8。
Csk SH2结构域直接与磷酸化Neph1结合。 A、，重组GST或GST-Neph1CD与谷胱甘肽-脑葡萄糖结合珠子，用或不用Fyn孵化。洗过之后，珠子与重组His标记的Csk SH2结构域和结合蛋白一起孵育用抗-His抗体进行免疫印迹。B、，293T细胞转染有指示的载体、抗FLAG免疫沉淀和通过Western blotting分析细胞裂解物(工作分解结构)对于FLAG标签，磷酸酪氨酸(对-Tyr)和Csk。C、，293T细胞转染所示载体和抗FLAG免疫沉淀物(知识产权)用Western blotting分析Csk的细胞裂解产物。
图9。
图9。
Neph1抑制Fyn诱导的ERK激活。293T电池与血凝素联合转染(哈)-标记的ERK表达式向量和Fyn表达式向量以及空表达式向量野生型Neph1或每个突变Neph1载体。抗血凝素或抗FLAG免疫沉淀物(知识产权)通过Western blotting进行分析(工作分解结构)带有指示的抗体。
图10。
图10。
提尔637在受伤的足细胞中被磷酸化在里面活泼地.A类，Neph1在鱼精蛋白硫酸盐诱导足细胞损伤的足突消失模型。用硫酸鱼精蛋白灌注大鼠肾脏20分钟在“实验程序”中描述。Anti-Neph1C免疫沉淀物(知识产权)来自对照或鱼精蛋白硫酸盐处理肾小球用抗Neph1C或抗磷酸酪氨酸抗体。B、，重组野生型，Y637F，或Y657F GST-Neph1CD孵化在体外用重组Fyn，然后用亲和纯化的兔多克隆进行免疫印迹抗磷酸化Neph1抗体（抗pY637）。C、，大鼠肾脏用硫酸鱼精蛋白灌注答：。肾小球裂解物抗Neph1C抗体的免疫沉淀和免疫沉淀通过SDS-PAGE进行分离，并用抗Neph1C或抗磷酸Neph1进行免疫印迹。D、，正常人和正常人肾小球裂解物的免疫印迹分析PAN处理的大鼠肾脏用抗磷酸-Neph1进行探测。工作分解结构，西部污点。
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