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.2006年1月30日；172(3):423-32.
doi:10.1083/jcb.200505175。

P21-活化激酶1：PDGF和LPA刺激人成纤维细胞胶原基质收缩的会聚点

李圣明 1, 弗雷德里克·格林奈尔
附属公司

P21-活化激酶1：PDGF和LPA刺激人成纤维细胞胶原基质收缩的会聚点

李圣明等。 J细胞生物学. .

摘要

成纤维细胞三维胶原基质培养提供了一种可用于分析细胞形态和功能的组织样模型。生理激动剂血小板衍生生长因子（PDGF）和溶血磷脂酸（LPA）均刺激人成纤维细胞收缩漂浮的胶原基质。在本研究中，我们表明，基质收缩所需的PDGF和LPA信号通路收敛于p21-活化激酶1（PAK1）及其下游效应器cofilin1，收缩取决于细胞皱褶活性，而不是细胞树突延伸的突起和收缩。我们还表明，依赖于激动剂，不同的Rho效应器与PAK1合作调节基质收缩，PDGF中的Rho-激酶和LPA中的mDia1。这些发现为理解漂浮胶原基质的成纤维细胞收缩所涉及的细胞信号通路建立了一个统一的框架。

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数字

图1。
图1。
PAK1在人成纤维细胞和细胞形态中的沉默。（A） 用700 nM siRNA或仅sense RNA（Mock）转染细胞12 h，并在无siRNA的生长培养基中再培养24 h。制备提取物并进行SDS-PAGE和免疫印迹，以分析PAK1、PAK2和微管蛋白的水平。（B） 采集PAK1诱导和模拟转染的细胞，并将其置于含有5 mg/ml BSA和10μM LPA或50 ng/ml PDGF的DME中的胶原涂层玻璃盖玻片上培养1 h。孵育结束时，固定样品并对其进行肌动蛋白染色。棒材，50μm。
图2。
图2。
沉默PAK1抑制细胞迁移。（A） 收集PAK1诱导和模拟转染的细胞，并在胶原涂层的盖玻片上培养过夜。刮伤后，将培养物培养在含有5 mg/ml BSA和50 ng/ml PDGF的DME中。在孵育结束时，样品固定并染色肌动蛋白。（B） 通过测量10个单独的显微镜场和每个场中的5个细胞，确定细胞从伤口边缘迁移的平均距离，从而量化迁移。棒材，150μm。
图3。
图3。
PAK1修饰的人成纤维细胞在胶原基质中培养1小时后，树枝状突起和皱褶。（A） 收集PAK1融合细胞和模拟转染细胞，并用于制备漂浮胶原基质。样品在含有5 mg/ml BSA和50 ng/ml PDGF或10μM LPA的DME中培养1 h，如图所示。在培养结束时，样品被固定，并用微管的抗微管蛋白抗体和肌动蛋白的罗丹明-球蛋白染色。（B） 盒状区域树枝状延伸尖端的放大视图。绿色，微管；红色，肌动蛋白。棒材，20μm。
图4。
图4。
PAK1诱导的成纤维细胞在胶原基质中孵育4小时后，树突状延伸和皱褶。（A） 收集PAK1融合细胞和模拟转染细胞，并用于制备漂浮胶原基质。样品在含有5 mg/ml BSA和50 ng/ml PDGF或10μM LPA的DME中培养4 h，如图所示。在培养结束时，样品被固定，并用微管的抗微管蛋白抗体和肌动蛋白的罗丹明-球蛋白染色。（B） 盒状区域树枝状延伸尖端的放大视图。绿色，微管；红色，肌动蛋白。棒材，20μm。
图5。
图5。
抑制PAK1诱导细胞中胶原基质收缩。收集未转染（对照组）、PAK1修饰细胞和模拟转染细胞，并用于制备漂浮胶原基质。如图所示，样品在添加了5 mg/ml BSA和50 ng/ml PDGF或10μM LPA的DME中培养4小时。孵育结束时，固定样品，并测量基质收缩程度，即基质直径的减小。所示数据为三个单独实验的算术平均值±SD。
图6。
图6。
PDGF刺激而非LPA刺激的胶原基质收缩需要PI3激酶和Rho激酶。（A） 采集成纤维细胞并用于制备漂浮胶原基质。样品在DME中孵育4小时，DME中添加5 mg/ml BSA和50 ng/ml PDGF、10μM LPA、20μM LY294002（LY；PI3激酶抑制剂）和10μM Y27634（Y；Rho激酶抑制剂）。培养结束后，固定样品，并测量基质收缩程度，即基质直径的减小。所示数据为三个单独实验的算术平均值±SD。（B） 从A中选取的样本进行固定，并用微管（绿色）的抗微管蛋白抗体和肌动蛋白的罗丹明-拟磷脂（红色）进行染色。盒状区域树枝状延伸尖端的放大视图。棒材，20μm。
图7。
图7。
百日咳毒素抑制LPA刺激而非PDGF刺激的胶原基质收缩。（A） 单层培养的成纤维细胞与25 ng/ml百日咳毒素孵育过夜。随后，收集细胞并用于制备漂浮胶原蛋白基质。样品在DME中孵育4小时，在指定位置添加5 mg/ml BSA和50 ng/ml PDGF或10μM LPA。培养结束后，固定样品，并测量基质收缩程度，即基质直径的减小。所示数据为三个单独实验的算术平均值±SD。（B） 从A中选取的样本进行固定，并用微管（绿色）的抗微管蛋白抗体和肌动蛋白的罗丹明-球蛋白（红色）进行染色。（右）方框内树枝状延伸尖端的放大视图。棒材，20μm。
图8。
图8。
在LPA和PDGF对胶原基质收缩的调节中，Cofilin1是PAK1的下游。（A） 收集PAK1融合细胞和模拟转染细胞，并用于制备漂浮胶原基质。样品在含有5 mg/ml BSA和50 ng/ml PDGF或10μM LPA的DME中培养，如图所示。在孵育结束时，制备样品提取物，并用针对磷酸-辅酶1和微管蛋白的抗体进行免疫印迹。（B） 用500 nM的cofilin1 siRNA或仅sense RNA（Mock）转染细胞36 h，然后在不含siRNA的生长培养基中再培养24 h。制备提取物并进行SDS-PAGE和免疫印迹，以分析cofilin 1（箭头）和tubulin的水平。（C） 收获未转染的（CTL）、cofilin1沉默的和模拟转染的细胞，并用于制备漂浮的胶原基质。如图所示，样品在添加了5 mg/ml BSA和50 ng/ml PDGF或10μM LPA的DME中培养4小时。在植入结束时，固定样品，并测量基质收缩程度作为基质直径的减小。所示数据为三个单独实验的算术平均值±SD。
图9。
图9。
mDia1与PAK1协同LPA调节人成纤维细胞胶原基质收缩沉默。（A） 用700 nM siRNA或仅sense RNA（Mock）转染细胞12 h，并在不含siRNA的生长培养基中再培养24 h。制备提取物并进行SDS-PAGE和免疫印迹分析mDia1和肌动蛋白水平。（B） 收集mDia1沉默和模拟转染细胞，并用于制备漂浮胶原基质。如图所示，样品在添加了5 mg/ml BSA和50 ng/ml PDGF或10μM LPA的DME中培养4小时。在培养结束时，固定样品，并测量基质收缩程度，即基质直径的减小。所示数据为三个单独实验的算术平均值±SD。（C） 转染期结束时，将模拟和siRNA转染的细胞在无血清培养基中培养36 h，然后在DME中培养4 h，如图所示添加5 mg/ml BSA和50 ng/ml PDGF或10μM LPA。如前所述，检测到稳定的微管（Gundersen等人，1994年；Cook等人，1998年）。随后，将指示的样品用2μM诺可达唑处理2小时。用微管稳定缓冲液（MSB；85 mM管道，pH 6.9，1 mM EGTA，1 mM-MgCl）冲洗两次后2、2 M甘油、1μg/ml亮氨酸蛋白酶抑制剂、1μg/ml胃蛋白酶抑制素A和1 mM 4-（2-氨基乙基）-苯磺酰氟），样品在37°C下用1 ml含有200μg/ml皂苷的MSB处理5分钟，以提取微管蛋白单体，用MSB冲洗，用甲醇（−20°C）固定10分钟，然后用抗微管蛋白抗体染色。棒材，50μm。
图10。
图10。
漂浮胶原基质收缩的信号通路。显示PDGF和LPA信号在PAK1和cofilin1、细胞皱褶和胶原基质收缩上收敛的模型。Rho激酶与PAK1合作进行PDGF刺激的收缩，而mDia1与PAK1合作进行LPA刺激的收缩。Rho激酶也是LPA刺激的树突状延伸收缩所必需的。
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