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.2006年2月；26(3):843-51.
doi:10.1128/MCB.26.3.843-851.2006。

MBD2/NuRD和MBD3/NuRD是两种不同的复合物，具有不同的生化和功能特性

泽维尔·勒·盖泽内克 1, 米歇尔·弗默伦, 阿里·布林克曼, Wieteke A M Hoeijmakers公司, 阿德里安·科恩, 埃德温·拉森德, 亨德里克·斯登伯格
附属公司

MBD2/NuRD和MBD3/NuRD是两种不同的复合物，具有不同的生化和功能特性

泽维尔·勒·盖泽内克等。 分子细胞生物学. 2006年2月.

摘要

人类基因组包含许多甲基CpG结合蛋白，这些蛋白将DNA甲基化转化为生理反应。为了深入了解MBD2和MBD3的功能，我们首先应用了蛋白质标签和质谱。我们证明MBD2和MBD3组装成相互排斥的独特Mi-2/NuRD类复合物，称为MBD2/NuRD和MBD3/NuRD。我们确定DOC-1是一种假定的肿瘤抑制因子，是MBD2/NuRD和MBD3/NuRD的一种新的核心亚单位。PRMT5及其辅因子MEP50被鉴定为特定MBD2/NuRD相互作用物。PRMT5与MBD2富含RG的N末端稳定而特异地结合并甲基化。染色质免疫沉淀实验表明，PRMT5和MBD2在体内以甲基化依赖的方式被招募到CpG岛，PRMT底物H4R3在这些位点被甲基化。我们的数据表明，MBD2/NuRD和MBD3/NuRD是不同的蛋白质复合物，具有不同的生化和功能特性。

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数字

图1。
图1。
TAP-MBD2和TAP-MBD3组装成功能类似Mi-2/NuRD的复合体。（A） 来自表达TAP-MBD2或TAP-MBD3的稳定细胞系的全细胞提取物的超6凝胶过滤。使用ProtA抗体通过Western blotting分析组分。列的空隙显示在分数7和8之间。（B） 重组组蛋白重组的核糖体模板被乙酰化酿酒酵母SAGA或NuA4复合物，然后在不存在或存在胰蛋白酶大豆琼脂的情况下与TAP-MBD2或TAP-MBD3复合物孵育（38）。H3或H4乙酰化的量分别使用双乙酰化组蛋白H3 Lys-9、14或四乙酰化H4的抗体通过Western blotting测定。MBD2和MBD3复合物与核小体模板的结合通过使用Myc和HDAC2抗体的Western blotting进行测定。（C） 如前所述，使用纯化MBD2和MBD3复合物在GAM12探针上进行电泳迁移率变化分析（27）。移动的甲基化探针用箭头表示。自由探头用星号表示。
图2。
图2。
MBD2和MBD3相互排斥。（A） 来自HEK 293细胞的纯化的MBD2和MBD3复合物的银染凝胶。MBD3用箭头表示。（B） 使用MBD3抗体通过Western blotting分析纯化的TAP-MBD2和TAP-MBD3复合物以及从HEK 293或HeLa细胞中提取的全细胞提取物。（C） 分别使用Strep-tachin或IgG珠免疫沉淀MBD2和MBD3。途径：1、对stII-3HA-MBD2-ProtA-Myc-MBD3提取物进行链霉菌纯化；2、HEK 293野生型提取物的链球菌纯化；3、用stII-3HA-MBD2 ProtA-Myc-MBD3提取物纯化IgG；4、用HEK 293野生型提取物纯化IgG；5、输入HEK 293提取物；6，输入stII-3HA-MBD2 ProtA-Myc-MBD3提取物。用HA或ProtA抗体通过Western blotting分析洗脱的蛋白质。用HDAC1抗体探测印迹显示HDAC1与MBD2和MBD3共沉淀。（D） 内源性MBD2和MDB3的免疫沉淀。使用针对MBD3（IBL，日本）或MBD2（Upstate Biotechnology）的抗体对HeLa细胞的全细胞提取物进行免疫沉淀。使用相同的抗体进行蛋白质印迹。
图3。
图3。
PRMT5与MBD2的N-末端RG-丰富重复序列相互作用并甲基化。（A） 纯化的TAP-MBD2和TAP-MBD3复合物使用PRMT5抗体通过Western blotting进行分析。（B） 带有RG重复序列的MBD2序列带下划线。（C） 纯化MBD2复合物与S公司-[14C] 腺苷蛋氨酸。甲基化蛋白质用箭头表示。自由标签用星号表示。使用IgG珠纯化MBD2复合物。左侧面板描述了纯化MBD2复合物的Western blot分析，或使用抗ProtA-辣根过氧化物酶抗体的293对照纯化。箭头显示TAP标记的MBD2。（D） （左面板）重组GST-RG（n）和GST-MBD2的体外甲基化S公司-[14C] 腺苷甲硫氨酸和纯化的PRMT5/MEP50馏分（中间面板）或纯化的MBD2复合物（顶部面板）。GST-PAH2作为阴性对照。（右面板）重组GST-RG（n）、缺乏RG拉伸的GST-MBD2和存在S公司-[14C] 腺苷甲硫氨酸和纯化的PRMT5/MEP50馏分（中间面板）或纯化的MBD2复合物（顶部面板）。自由标签用星号表示。底部面板中显示了GST-PAH2、GST-RG（n）、GST-MBD2、GST MBD2（缺少RG拉伸）和GST-MBD3的加载控制。（E） 来自HEK 293细胞的纯化N-末端截短MBD2复合物的银染色凝胶。该表显示了FT-MS/MS分析，包括所有识别的蛋白质及其各自的肽数量和序列覆盖率。
图4。
图4。
MBD2招募PRMT5到染色质。（A） ChIP实验中使用的引物集的示意图。外显子用黑色矩形表示。CpG岛以灰色表示。底漆对用箭头表示。（B） MCF7细胞MBD2、MBD3、PRMT5和MTA2的ChIP分析。显示了控制BMX区域的相对占用率。数值是三个独立的染色质分离的ChIP实验结果的平均值和标准偏差。（C） 5-氮杂胞苷处理的MCF7细胞的ChIP分析。用抗MBD2、MBD3、MTA2、PRMT5和抗二甲基组蛋白H4（Arg3）的抗体进行免疫沉淀。显示了在控制BMX区域上的相对占有率。数值是三个独立的染色质分离的ChIP实验结果的平均值和标准偏差。
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参考文献

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