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.2002年3月；22(6):1754-66.
doi:10.1128/MCB.22.6.1754-1766.2002。

IAP抑制凋亡涉及不同的机制：TAK1/JNK1信号级联和caspase抑制

M Germana桑拿 1, 让·达席尔瓦·科雷亚, 奥迪尔·杜克里, Jongdae Lee公司, Ken Nomoto（肯·诺莫托）, 尼古拉斯·施兰茨, 奎因·L·德芙罗, 理查德·尤利维奇
附属公司

IAP抑制凋亡涉及不同的机制：TAK1/JNK1信号级联和caspase抑制

M Germana桑拿等。 分子细胞生物学. 2002年3月.

摘要

凋亡抑制蛋白（IAP）家族的抗凋亡特性与半胱氨酸蛋白酶抑制有关。我们之前描述了XIAP抑制凋亡的另一种机制，该机制依赖于JNK1的选择性激活。这里我们报告了IAP家族的另外两个成员NAIP和ML-IAP都激活了JNK1。催化失活JNK1的表达阻断了NAIP和ML-IAP对ICE-和TNF-α诱导的凋亡的保护，表明JNK1-的激活对于这些蛋白的抗凋亡作用是必要的。MAP3激酶TAK1似乎是这种抗凋亡途径的重要组成部分，因为当催化失活的TAK1表达时，IAP介导的JNK1的激活以及对TNF-α和ICE诱导的细胞凋亡的保护作用被抑制。此外，XIAP、NAIP和JNK1绑定到TAK1。重要的是，无催化活性的TAK1的表达并不影响XIAP对caspase活性的抑制。这些数据表明，XIAP的抗凋亡活性是通过两种不同的机制实现的：一种需要TAK1依赖的JNK1激活，另一种涉及caspase抑制。

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数字

图1。
图1。
XIAP、NAIP和ML-IAP选择性激活JNK激酶。在不存在或存在增加浓度的XIAP、NAIP-BIR1-3或ML-IAP（200或800 ng）的情况下，用编码JNK1（A）、p38或ERK2（B）、JNK2（C）或JNK3（D）的载体转染293T细胞。通过添加对照pcDNA3载体，每个样本中的转染cDNA数量保持不变。以ATF-2或MBP为底物进行体外激酶检测。激酶活性由磷酸成像仪定量，并表示为相对于每个MAP激酶磷酸化基础水平的折叠诱导。紫外和佛波酯醋酸酯作为阳性对照。每个实验都报告了JNK1表达水平相等的蛋白质印迹。XIAP、NAIP-BIR1-3或ML-IAP的表达水平在每个实验中是可比较的，因此仅显示在图A中。
图2。
图2。
XIAP、NAIP和ML-IAP需要JNK1来防止凋亡。（A） wt JNK1、JNK1-（AF）或p38（AF，p38）对XIAP、NAIP或ML-IAP对TNF-α诱导的细胞凋亡的保护作用。用对照载体pcDNA3单独或编码XIAP、NAIP-BIR1-3或ML-IAP的质粒（每个200 ng）转染MCF7细胞，并将对照载体wt JNK1、JNK1（AF）或p38（AF，每个800 ng）作为对照。用TNF-α处理转染细胞12 h（100 ng/ml），并按照材料和方法中的描述进行处理。使用X-Gal染色和AnnexinV-PE/FACS分析测定对细胞活力的影响。%凋亡，β-Gal阳性细胞（转染细胞）中凋亡细胞的发生率。数据表示至少三个实验的平均值±标准误差，每个实验重复进行，并进行盲评分。*，P（P）<0.05（由未配对t吨测试）；**，P（P）< 0.001. 将数值与仅表达pcDNA3的对照样品进行比较。（B） wt JNK1或JNK1（AF）对XIAP、NAIP或ML-IAP对ICE诱导的凋亡的保护作用。用编码ICE-β-Gal的质粒单独转染293T细胞（200 ng），或与wt JNK1、JNK1（AF）或p38（AF。添加父母pcDNA3载体以使转染DNA的数量正常化。
图3。
图3。
XIAP、NAIP和ML-IAP独立于MKK7/MKK4激活JNK1。在存在或不存在XIAP（A）、NAIP（B）或ML-IAP（C）（各200 ng）的情况下，与JNK1（100 ng）一起共同转染增加量（从200 ng到800 ng）的wt MK7或MKK7（KM）。以ATF-2为底物对免疫沉淀的JNK1进行体外激酶检测，并用磷光成像仪定量激酶活性。Western blotting显示，分别使用抗FLAG和抗HA抗体，JNK1和wt MKK7或MKK7KM表达一致。UV活化显示为JNK1活化的阳性对照。标准偏差始终小于6%。
图4。
图4。
XIAP、NAIP和ML-IAP通过TAK1激活JNK1。（A、B、C）LacZ、TAK1（KW）或ASK1（KM）对XIAP-、NAIP-和ML-IAP相关JNK1激活的影响。将编码野生型JNK1（100 ng）和不断增加的XIAP、NAIP-BIR1-3或ML-IAP（200和600 ng）的质粒转染到稳定表达LacZ控制基因（A）、TAK1（KW）（B）或ASK1（KM）（C）的293T细胞中。以ATF-2为底物，对免疫沉淀JNK1进行体外激酶检测，并用荧光成像仪定量激酶活性。还显示了紫外线刺激。Western blotting显示JNK1的表达相同。TAK1（KW）的表达没有改变XIAP、NAIP或ML-IAP的表达（数据未显示）。（D） XIAP、TAK1和TAB1对JNK1激活的影响。用编码JNK1（100 ng）加XIAP（600 ng）、TAK1（15 ng）或TAB1（5 ng）的载体单独或联合转染293T细胞。使用ATF-2作为底物进行体外激酶测定。激酶活性水平表示为折叠诱导归一化为XIAP介导的JNK1激活。
图5：。
图5：。
XIAP、NAIP和JNK1与体内TAK1相互作用。（A） XIAP、JNK1或JNK1（AF）与TAK1或TAK1（KW）的体内相互作用。编码XIAP-FLAG、JNK1-FLAG或JNK1（AF）-FLAG的载体与wt TAK1-HA或TAK1（KW）-HA共同转染293T细胞。使用抗FLAG抗体结合珠免疫沉淀（IP）细胞提取物。用抗HA抗体通过Western blot分析检测共沉淀TAK1或TAK1（KW）。细胞提取物也直接进行免疫印迹分析（IB）以检查蛋白表达。星号表示使用抗-HA抗体时出现的非特定带。（B） NAIP或ML-IAP与TAK1或TAK1的相互作用（KW）。编码NAIP-BIR1-3-Myc或ML-IAP-Myc的载体与TAK1-HA或TAK1（KW）-HA在293T细胞中共转染。使用抗Myc抗体免疫沉淀细胞提取物。用抗HA抗体通过Western blot分析检测共沉淀TAK1或TAK1（KW）。细胞提取物也直接进行免疫印迹分析以检查蛋白表达。
图6。
图6。
XIAP、NAIP和JNK1直接与TAK1交互。（A和B）XIAP或JNK1与TAK1的体外相互作用。GST-XIAP或HIS-JNK1或各自的阴性对照GST和HIS-肽重组蛋白与谷氨酸或Ni-NTA结合珠培养，并在体外添加翻译的TAK1蛋白。使用抗TAK1抗体通过Western blotting检测TAK1的共沉淀。使用抗GST和抗HIS抗体通过蛋白质印迹检测输入蛋白。
图7。
图7。
XIAP、NAIP和ML-IAP与TAB1相互作用。（A） XIAP、JNK1或JNK1（AF）与TAB1的相互作用。编码XIAP-FLAG、JNK1-FLAG或JNK1（AF）-FLAG的载体与TAB1共转染293T细胞。用抗TAB1抗体对细胞提取物进行免疫沉淀，并用抗FLAG抗体通过Western blot分析检测共沉淀XIAP、JNK1或JNK1（AF）。细胞提取物进行免疫印迹分析以检查蛋白表达。（B） NAIP或ML-IAP与TAB1的相互作用。编码NAIP-BIR1-3-Myc或ML-IAP-Myc的载体与293T细胞中的TAB1共转染。细胞提取物用抗TAB1抗体进行免疫沉淀，沉淀的NAIP或ML-IAP用抗Myc抗体进行Western blot分析。细胞提取物进行免疫印迹分析以检查蛋白表达。
图8。
图8。
TAK1（KW）抑制XIAP、NAIP和ML-IAP对TNF-α和ICE诱导的凋亡的保护作用。（A） TAK1或TAK1（KW）对XIAP、NAIP或ML-IAP对TNF-α诱导的凋亡的保护作用。用编码XIAP、NAIP-BIR1-3或ML-IAP（各200 ng）的质粒以及对照载体或增加wt TAK1或TAK1（KM）浓度（200和800 ng）转染MCF7-Fas细胞。表达β-Gal（200 ng）的质粒也被转染以定量凋亡细胞。也显示了无IAP的空矢量TAK1或TAK1（KW）（每个800 ng）的表达效果。用TNF-α（100ng/ml）处理细胞，并按照材料和方法中所述进行处理。通过X-Gal染色（如图所示）和AnnexinV-PE/FACS分析（未显示）确定对细胞活力的影响，并产生类似的结果。%凋亡，β-Gal阳性细胞（转染细胞）中凋亡细胞的发生率。数据表示至少三个实验的平均值±标准误差，每个实验重复进行，并进行盲分。（B和C）TAK1（KW）对XIAP、NAIP或ML-IAP对ICE诱导凋亡的保护作用。在不存在或存在wt TAK1、TAK1（KW）、XIAP、NAIP-BIR1-3或ML-IAP（各300 ng）的情况下，用编码ICE-β-Gal（200 ng）的质粒转染293T细胞。添加父母pcDNA3载体以使转染DNA的数量正常化。通过X-Gal染色和AnnexinV PE/FACS分析测定细胞活力。箭头表示凋亡细胞的例子。（D） 激活的TAK1对细胞凋亡的影响。用编码ICE-β-Gal（100 ng）的质粒转染293T细胞，单独或不单独使用wt TAK1或TAB1（各50 ng）或结合增加浓度的JNK1（AF）（200和800 ng）。通过X-Gal染色和AnnexinV-PE/FACS分析测定细胞活力，并得出类似结果。
图9：。
图9：。
JNK1（AF）和TAK1（KW）不抑制XIAP、NAIP和ML-IAP对BAX或caspase诱导的凋亡的保护作用。（A和B）JNK1（AF）、TAK1（KW）或ASK1（KM）对XIAP保护BAX诱导的细胞凋亡的影响。将编码BAX（100 ng）或XIAP的质粒与以下其中一种质粒一起转染293T细胞：wt JNK1、JNK1-（AF）、TAK1、TAK1-（KW）、ASK1或ASK1-（KM）（各600 ng）。编码GFP的质粒也转染BAX单独或BAX加XIAP作为对照。将编码β-Gal（50 ng）的表达载体与不同质粒一起转染，以便对细胞进行形态学观察。如上所述测定对细胞活力的影响。箭头表示凋亡细胞的例子。（C） JNK1（AF）、TAK1（KW）或ASK1（KM）对XIAP抑制caspase活性的影响。将293T细胞接种在直径为100 mm的培养皿中，并用编码XIAP的质粒单独转染（3μg）或用以下其中一种质粒转染：wt JNK1、TAK1、ASK1、JNK1（AF）、TAK1（KW）或ASK1（KM）（3μg/）。空载体也单独转染作为对照（6μg）。制备细胞提取物和细胞色素c（c）添加以诱导蛋白酶原3的蛋白水解过程。通过监测含AFC DEVD的合成肽的释放来测定半胱氨酸天冬氨酸酶活性。
图10。
图10。
IAP激活JNK1的模型。IAP介导的JNK1激活通过TAK1并通过抑制TNF-α和ICE诱导的凋亡促进细胞存活。该事件与XIAP抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶分开（详见正文）。
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