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.2000年12月；20(23):8803-14.
doi:10.1128/MCB.20.23.8803-8814.2000。

磷酸化诱导的干扰素调节因子7二聚化揭示了DNA结合和二部分转录激活域

I Marié 1, E史密斯, A普拉卡什, D E征税
附属公司

磷酸化诱导的干扰素调节因子7二聚化揭示了DNA结合和二部分转录激活域

I Marié等。 分子细胞生物学. 2000年12月.

摘要

干扰素调节因子7（IRF7）是一种干扰素（IFN）诱导的转录因子，需要激活病毒感染后以延迟动力学表达的IFN-α基因子集。IRF7作为一种潜在蛋白合成，并通过受感染细胞中的蛋白磷酸化进行翻译后修饰。磷酸化需要一个羧基末端调控域，该调控域控制活性蛋白在细胞核中的保留，以及其与特定DNA靶序列的结合、多重聚合和诱导靶基因表达的能力。IRF7的转录激活映射到两个不同的区域，这两个区域都是完全活性所必需的，而所有功能在潜在的IRF7中都被一个到内部区域的自身抑制域映射所掩盖。通过将IRF7与雌激素受体（ER）的配体结合和二聚化结构域融合，构建了条件活性形式的IRF7。嵌合IRF7-ER的激素依赖性二聚化刺激内源性靶基因的DNA结合和转录反式激活。这些研究表明，IRF7活性是通过磷酸化依赖的变构变化来调节的，这种变构变化会导致二聚体化，并有助于核保留，解除反式激活，并允许特定的DNA结合。

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图1
图1
磷酸化IRF7积聚在细胞核中并与DNA结合。（A） NDV激活IRF7的等电聚焦分析。用IRF7-HA表达质粒转染293T细胞。在转染后16 h，细胞被模拟感染（第1道）或NDV感染（第2道）7 h，细胞提取物被免疫沉淀，并使用抗HA抗体通过自然等电聚焦和Western blotting进行分析。显示了IRF7和磷酸化IRF7（IRF7-P）的活性。（B） 磷酸化IRF7仅为核。用IRF7表达质粒转染293T细胞，用针对羧基末端的抗IRF7抗体对感染后9 h从模拟或NDV感染细胞制备的核（N）和细胞质（C）提取物进行Western blotting分析。显示了IRF7和磷酸化IRF7（IRF7-P）的活性。（C） IRF7结合DNA以应对病毒感染。如图所示，对来自载体转染的293T细胞（通道1和2）或表达IRF7-Flag的细胞（通道3至7）的细胞核（通道1至5）和细胞质（通道6和7）提取物进行EMSA。提取物与ISG15基因的ISRE探针孵育。将抗Flag M2抗体添加到反应混合物（通道5）中，以确认复合物的身份。
图2
图2
IRF7对IFN-α6启动子的反激活。（A） 用图示的IRF7剪接变异体和截短突变表达结构以及IFN-α6启动子驱动的荧光素酶报告子转染COS细胞。转染后24小时，细胞模拟感染（阴影条）或感染NDV 12小时（实心条），然后检测荧光素酶活性。这些值表示为与共转染β-半乳糖苷酶正常化后用空载体转染的细胞相关的折叠诱导。显示了重复进行的单个代表性实验的平均值。每个结构都在至少三个单独的实验中进行了测试，实验之间的差异小于10%。（B） IRF7Δ238–410缺乏自身抑制结构域对病毒感染没有反应。COS细胞被转染并按A组处理，但IRF7Δ减少了五倍238–410相对于野生型IRF7转染DNA。（C） IRF7Δ238–410构成性转录活性不需要磷酸化调控序列。用IRF7Δ转染细胞238–410或IRF7Δ238–410其中调节域磷酸化所需的两个丝氨酸残基被转化为丙氨酸（AA）。数据表示为干扰素-α6-luc报告子相对于其被病毒激活的野生型IRF7激活的折叠激活。
图3
图3
使用Gal4嵌合体绘制IRF7反式激活和自身抑制域的结构-功能图。Gal4-IRF7融合蛋白结构如左图所示，表明Gal4-DBD和IRF7的外显子结构。IRF7的不同功能区被着色。右侧显示了COS细胞中与所示Gal4-IRF7嵌合表达质粒共转染的Gal4上游激活位点荧光素酶报告子的折叠激活。在共转染β-半乳糖苷酶活性正常化后，这些值表示为相对于Gal4-DBD单独的基底激活的折叠诱导。该图表示重复进行的单个试验的平均值，并代表每个结构的至少三次试验。总体实验变化始终小于15%。请注意，构件1到9和10到11的结果以不同的比例绘制。（B） IRF7功能域图，由不同的阴影模式表示并在下面标记，总结了转染实验得出的数据。外显子被编号以便识别。
图4
图4
IRF7亚型诱导内源性IFN-α基因表达。（A） 状态1−/−如图所示，用编码IRF7剪接变异体和截断变异体的表达质粒瞬时转染成纤维细胞。36 h后，模拟细胞或感染NDV 9 h，用RT-PCR监测非干扰素-α4和GAPDH mRNA水平，如图所示。（B） IRF7在细胞质和细胞核中都有积累。通过Western blotting监测瞬时转染细胞提取物中每个IRF7剪接变异体或截断变异体的表达水平。在通道1、3、7和8中观察到的快速迁移形式（用*表示）很可能是蛋白水解分解产物。分子质量标记的迁移率以千道尔顿为单位显示在右边。
图5
图5
IRF7γ和IRF7ΔN102竞争性抑制IRF7介导的IFN-α6诱导。如图所示，COS细胞与编码IRF7α或IRF7β（50 ng）的表达结构共转染，IRF7γ（上部面板）或IRF6ΔN的量增加（0、250、1000和2000 ng）102（下部面板），以及由IFN-α6启动子驱动的荧光素酶报告子构建。转染后24小时，用NDV感染细胞12小时，并检测提取物的荧光素酶活性。这些值表示为共转染β-半乳糖苷酶活性归一化后无竞争对手的活性百分比，并表示重复测量的平均值。
图6
图6
磷酸化的IRF7显示出增加的天然分子大小。从转染IRF7的未感染对照（Ctl）细胞（上面板）或NDV感染（下面板）293T细胞中采集的核提取物通过甘油梯度沉淀进行分离。如图所示，在SDS-PAGE后通过免疫印迹分析单个组分的IRF7。顶部显示了平行梯度中分子质量标准的分馏，右侧显示了磷酸化和非磷酸化IRF7的电泳迁移率。
图7
图7
IRF7-ER的激素依赖性二聚化诱导特异性DNA结合和IFN-α基因表达。（A） IRF7-ER嵌合蛋白图。IRF7α（上部）和IRF7γ剪接变异体（下部）显示DBD、反式激活域（TA）、自身抑制域（Inhib.）、调节域（Reg）和雌激素LBD。（B） 如图所示，用IFN-α6-luc-plus载体、IRF7α-ER或IRF7γ-ER共同转染293T细胞，然后用4-HT处理16小时或不处理（Ctl），然后检测荧光素酶活性。数据显示为未经处理的载体转染细胞的折叠诱导，代表重复测量的平均和标准误差。（C） 与IFN-α6-luc-plus载体、野生型IRF7α、IRF7β-ER或IRF7（AA）-ER共转染的细胞未经处理或用4-HT处理16 h，然后检测荧光素酶活性。数据显示为转染野生型IRF7的NDV感染细胞中获得的最大活性百分比（未显示结果），并表示三次测定的平均值和标准误差。（D） 通过免疫印迹法测定转染293T细胞提取物中的IRF7α（第1道）、IRF7β-ER（第2道）和IRF7γ-ER（第一道）蛋白水平。（E） EMSA分析了转染IRF7α-ER（α-ER）或IRF7γ-ER（γ-ER）的细胞提取物，如图所示，这些细胞未经处理（第1和第3道）或用4-HT处理4小时（第2和第4道）。指出了IRF7-ER蛋白-DNA复合物的位置。（F） 状态1−/−成纤维细胞转染IRF7α-ER（1和2道）或IRF7γ-ER（3和4道），然后用4-HT处理6 h（偶数道）。如图所示，分析RNA的非干扰素-α4亚群表达或GAPDH。
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