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.1999年5月；10(5):1367-79.
doi:10.1091/mbc.10.5.1367。

Apg7p/Cvt2p：一种新的自噬必需的蛋白激活酶

I塔尼达 1, 北水岛, M清冈, M Ohsumi先生, 上野县, Y Ohsumi先生, E科米纳米
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Apg7p/Cvt2p：一种新的自噬必需的蛋白激活酶

I塔尼达等。 分子生物学细胞. 1999年5月.
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摘要

在酿酒酵母中，Apg12p-Apg5p结合系统对自噬至关重要。缀合反应需要Apg7p，因为Apg12p不能与apg7/cvt2突变体中的Apg5p形成缀合物。Apg7p与泛素激活酶Uba1p有显著相似性。在本文中，我们研究了Apg7p作为Apg12p活化酶的功能。血凝素标记的Apg12p与c-myc标记的Apg 7p共免疫沉淀。一个双杂交实验证实了这种相互作用。共免疫沉淀对硫醇还原试剂敏感。此外，在同时过度表达Apg7p和Apg12p的细胞的裂解液中检测到Apg7p的硫酯偶联物。这些结果表明，Apg12p通过硫酯键与Apg7p相互作用。对Apg7p的突变分析表明，Apg7p的Cys507是一个活性位点半胱氨酸，ATP结合域和半胱氨酸残基对Apg7与Apg12p结合形成Apg12p-Apg5p结合物至关重要。表达突变型Apg7ps、Apg7pG333A或Apg7p C507A的细胞在氨肽酶I的自噬和胞质-空泡靶向方面存在缺陷。这些结果表明，Apg7p是Apg12p-Apg5p结合所必需的一种新型蛋白激活酶。

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图1
图1
Apg12p通过硫酯键与Apg7p偶联。（A） Apg12p与Apg7p共免疫沉淀。pAPG7myc-314质粒（CEN）转化为apg7号机组产生HA标记Apg12p的Δ细胞表达c-myc标记的Apg7p。一个转化子被指定为YIT702菌株。pRS314载体用作对照。按照材料和方法中的描述制备细胞裂解物。用琼脂糖微球结合抗c-myc单克隆抗体（9E10）免疫沉淀c-myc标记的Apg7p。免疫沉淀在10%凝胶上进行SDS-PAGE，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。用αApg7N抗体（针对Apg7p）和抗HA小鼠单克隆抗体（16B12；针对HA标记的Apg12p）通过Western blotting检测蛋白质。（B） Apg12p与Apg7p共免疫沉淀对DTT敏感。如上所述制备YIT702菌株的细胞裂解液。用（DTT+）或不使用1 mM DTT（DTT-）煮沸裂解产物。如上所述进行免疫沉淀和蛋白质印迹。（C） 在过度表达Apg7p和Apg12p的细胞中，Apg7p的高分子量带对β-巯基乙醇敏感。在MVD培养基中生长到早期对数期的细胞被收获，并在球体成形液中转化为球体。在1.3 M山梨醇缓冲液中收集球状体，用4×SDS样品缓冲液（Ausubel等。（1995）和蛋白酶抑制剂混合物（Sigma）。在存在（βME+）或不存在（βME−）3%β-巯基乙醇的情况下，将裂解液煮沸5分钟。如上所述，在7%凝胶上进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。pYO324/pAPG12HA-426：YIT704细胞株；pAPG7myc-314/pAPG12HA-316：YIT702细胞株；pAPG7myc-324/pAPG12HA-426：菌株YIT703细胞。
图2
图2
Apg7p在体内与Apg12p相互作用。第GBD-APG7页(TRP1号机组)和pGAD-APG12(LEU2级)转化为PJ69-4A菌株(gal4Δgal80Δtrp1 leu2 GAL2-ADE2 GAL1-HIS3)分别表达GAL4BD-Apg7p和GAL4AD-Apg12p。pGAD-C1和pGBD-C1作为对照。将细胞接种在SC-Trp-Leu平板（阳性对照）和SC-Ade-His-Trp-Lule平板上，并在30°C下孵育3 d。PJ69-4A菌株从底部逆时针方向携带pGBD-C1和pGAD-C1（GBD GAD）、pGBD-C1和pGAD-APG12（GBD GA G12）、pGB d-APG7和pGAD C1（GBD-APG7-GAD），以及pGBD-APG 7和pGA d-APG1（GBD-AP G12）。一株同时表达GAL4BD-Apg7p和GAL4AD-Apg12p的菌株在SC-Ade-Trp-Leu平板上生长良好，表明Apg7p与Apg12p相互作用。
图3
图3
Apg7p的ATP结合域和活性位点半胱氨酸对于通过硫酯键与Apg12p结合至关重要。（A） 点突变位点用图表表示。甘氨酸333在预测的Apg7p的ATP结合域中，通过定点突变被改变为丙氨酸，Cys507Apg7p也改为Ala。（B）Apg7pG333A型和Apg7pC507A型在酵母细胞中的表达水平与Apg7p相似。这个apg7号机组Δ携带pRS314（载体）的菌株、野生型菌株YIT702、G333A和C507A细胞在MVD培养基中生长并裂解。如图1A所示，对c-myc标记的Apg7p蛋白进行免疫沉淀。（C） 无Apg12p与Apg7p共免疫沉淀G333A型和Apg7pC507A型免疫沉淀YIT702（野生型）、YIT7G333A（G333A）和YIT7C507A（C507A）菌株细胞裂解液中的.c-myc–标记的Apg7p，并用上述抗HA抗体通过Western blotting检测共免疫沉淀物。
图4
图4
第7页G333A型和Apg7pC507A型在Apg12p–Apg5p缀合物的形成中显示出显著的缺陷。如前所述，使用αHA抗体通过Western blotting检测表达HA标记的Apg12p的细胞裂解物中的结合物（水岛等。1998年a）。pAPG7myc-314/pRS316：apg7号机组Δ细胞仅表达c-myc标记的野生型Apg7p；pRS314/pAPG12HA-316：apg7号机组仅表达HA标记Apg12p的Δ细胞；pAPG7myc-314/pAPG12HA-316：YIT702细胞株；pAPG7G333Amyc-314/pAPG12HA-316：菌株YIT7G333A细胞；pAPG7C507Amyc-314/pAPG12HA-316：菌株YIT7C507A细胞。
图5
图5
Apg7p的ATP结合域和活性位点半胱氨酸对自噬至关重要。（A） 格莱333和Cys507在氮保护条件下，Apg7p对自噬体的积累至关重要。将在MVD+Ura培养基中生长到早期对数期的细胞转移到PMSF存在的保氮培养基中，并在30°C下培养8 h。显示了具有代表性的Nomarski细胞图像。自噬体堆积在apg7号机组携带pAPG7myc-314（a）的Δ细胞。很少有自噬体聚集在apg7号机组Δ细胞携带pRS314（b）、pAPG7G333Amyc-314（c）和pAPG7 C507Amyc-314（d）。（B） 自噬进入apg7号机组表达Apg7p的Δ细胞G333A型和Apg7pC507A型通过碱性磷酸酶处理试验进行监测。我们构建了菌株YTS2(pho8:：pho8Δ60 apg7:：HIS3 trp1)并用质粒pRS314（载体）、pAPG7myc-314（野生型）、pAPG7G333Amyc-314（G333A）和pAPG7C507Amyc-314（C507A）将其转化。将在MVD+Ade+Ura培养基（N+）中对数生长的细胞转移到保氮培养基中，并在30°C（N−）下培养4h。Noda描述了在富氮或保氮条件下测量细胞碱性磷酸酶活性的方法等。（1998年）。（C） 格莱333和Cys507在氮保护条件下，Apg7p对细胞生存至关重要。将细胞置于含10μg/ml韧皮酚B的保氮培养基上，并在30°C下孵育3d。非活细胞被染成红色（单色为灰色），而活细胞则未被染成白色（单色）。
图6
图6
Apg7p的ATP结合域和活性中心半胱氨酸对于API的胞浆-空泡靶向至关重要。如水岛所述，对对数生长的细胞中API的处理进行了测量等。（1998年a）。车道对应于图4中的车道。
图7
图7
Apg7p存在于胞浆中。野生型菌株（YW5–1B）在MVD+Ura+Trp培养基中培养，转移到保氮培养基中，并孵育30分钟。营养生长的细胞在富缓冲液（1%酵母提取物、2%多肽酮、0.5%葡萄糖和0.7 M山梨醇）中转化为球形体，而保氮细胞在保氮缓冲液（0.15%酵母氮碱，不含氨基酸和硫酸铵，2%葡萄糖和0.9M山梨醇）中转化为球形体。按照黄和蒋（1997）的描述，通过离心法对细胞进行裂解和分离。LSP，15000×克颗粒；HSP，100000×克颗粒；高速钢，100000×克上清液。
图8
图8
Apg7p与Uba1p及其亲属有远亲关系。（A） 之间相似域的示意图表示UBA1、UBA2、UBA3、和APG7公司如图所示，假定活性位点半胱氨酸位于相似框III（UBA域）内。基本的ATP结合域位于相似性框I中。UBA1公司在相似性框Ib中包含另一个ATP结合基序，这对功能来说是不必要的。相似性框对应于约翰逊的相似性框等。（1997）和Liakopoulos等。（1998），除了方框Ib。（B）E1酶的系统发育树。包含ATP-结合域和活性位点半胱氨酸的E1类酶的同源区域通过CLUSTAL W多重比对程序进行多比对和分析（Thompson等。，1994年）。显示ScAPG7（残留物321-520酿酒酵母Apg7p；PID:g731742），PpAPG7（残留物322-521巴氏杆菌Gsa7p）、HsAPG7/GSA7（残留235-434智人APG′7/GSA7）、SpAPG7/GSA6（残留332-531葡萄裂殖酵母Apg7p/Gsa7p；PID g2894280），HsUBA1（残留物465至664智人UBA1；PID:g340072），MmUBA1（残留物465-664小家鼠UBA1；PID:g220629），ScUBA1（残留431-630酿酒酵母Uba1p；PID:g4715），AtUBA1（残留物489至688拟南芥UBA1；PID:g1750376），TaUBA1（残留物459至658小麦UBA1；PID g136632），ScUBA2（残留18至219酿酒酵母Uba2p；PID:g1717852），SpUBA2（残留物22-221S.pombe公司Uba2p；PID:g2956755），HsUBA3（残留物45至244智人UBA3；PID:g3342564）和ScUBA3（剩余物1至200酿酒酵母Uba3p；PID:g2980755）（哈特菲尔德等。, 1990; 汉德利等。, 1991; 麦格拉思等。, 1991; 今井等。，1992年；多门等。，1995年；哈特菲尔德等。, 1997; 利亚科普洛斯等。, 1998; 水岛等。1998年a；大阪等。，1998，元等。, 1999).
图9
图9
关于Apg7p在Apg12p共轭系统中功能的工作假设。Apg12p与Apg7p关联。Apg12p与Cys共轭的C-末端Gly507在Apg7p中通过硫代酯键以ATP依赖的方式。该反应发生在Apg12p相关隔室的细胞质或细胞质侧。虽然E2酶尚未被鉴定，但其中一个候选酶是Apg10p。
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参考文献

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