PKCα整合时空差异钙²⁺和自分泌BDNF信号以促进突触可塑性

树突棘可塑性过程中经典PKC同工酶的活性

利用这些新的传感器，我们研究了在诱导单棘结构长时程增强（sLTP）过程中经典PKC同工酶的活性：一个功能性突触可塑性和学习的稳健模型^27,28在零细胞外镁浓度下，0.5 Hz的双光子谷氨酸去细胞脉冲序列在海马CA1锥体神经元二级或三级顶树突上的单个脊髓中诱导了.sLTP²⁺如前所示，这种刺激导致受刺激脊柱的尺寸和功能强度持续增加²⁸用ITRACK监测PKC同工酶的活性(图2A)在sLTP期间，以128 ms的时间分辨率在受刺激脊椎和周围树突中。在每一次谷氨酸开盖脉冲中，经典PKC在受刺激的脊椎（PKCα：图2B-D、视频S1、PKCβ、PKCγ：图S1C). PKC活性在受刺激的脊椎和受刺激脊椎正下方的一小段树突（~1μm）中被划分，这表明在可塑性中具有脊椎特异性、空间局限性的作用(图2F，G). 为了量化PKC激活的衰减动力学，图2E). 这揭示了三种经典PKC同工酶的活性差异：PKCα比PKCβ和PKCγ具有更大的峰值振幅和更长的衰减常数(图2E)因此，经典同工酶中最大的平均激活度（PKCα：5.66±0.64，PKCβ：2.3±0.11，PKCγ：1.43±0.12%，图S1C插图）。

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图2：

结构可塑性诱导强健、分区和快速的PKCα活性

A） ITRACK传感器设计。

B、 C）接受sLTP的单个脊柱中ITRACKα的荧光寿命图像（B）和量化（C）。白点（B）和黑色破折号（C）表示谷氨酸未加糖。荧光寿命数据（黑色）可以通过计算ITRACKα供体（eGFP标记的PKCα）与ITRACKα受体（膜靶向mCh）进行FRET的百分比来量化为易位百分比（蓝色）。

D） sLTP期间用ITRACKα测定PKCα活性的平均时间进程。n[神经元/脊椎]=32/103。阴影区域代表SEM。

E） ITRACK对每个谷氨酸去盖脉冲的平均响应（去盖触发平均值，阴影区域为SEM）以及PKCα（τ=0.61±0.07 s，n[神经元/棘]=32/103）、PKCβ（τ=0.48±0.11 s，n/神经元/棘）=13/31）和PKCγ（τ=0.28±0.04 s，n[neuros/棘]=10/27）的衰减时间常数。组间未共享额外的平方和F检验-Yo和K（1/τ）p<0.0001。

F） sLTP期间ITRACKα的未老化触发荧光寿命图像的平均值。白点表示谷氨酸开盖的位置。

G） 受刺激脊椎（红色）和相邻树突延伸中PKCα平均峰值活性的空间分布（n[神经元/脊椎]=4/17）。使用非线性回归计算的空间衰减常数。误差条代表SEM。

H） IDOCKS传感器设计。

一、 J）接受sLTP的单个脊柱IDOCKSα荧光寿命图像（I）和量化（J）

K） sLTP期间用IDOCKSα测量的PKCα的平均时间进程（n[神经元/脊髓]=6/28。显示平均值和SEM（阴影））。

五十） 通过IDOCKS测量PKCα（n[神经元/棘突]=6/28）、PKCβ（n[神经细胞/棘突]=6/24）和PKCγ（n[细胞/=8/29）的非老化触发平均值（平均值和SEM（阴影））。

为了测试PKC不仅转移到膜上，而且在此时间尺度上结合下游底物，我们使用IDOCKS测量PKC活性(图2H). 与使用ITRACK测量的活性曲线类似，IDOCKS报告了PKC同工酶的快速激活，以响应可塑性的诱导（PKCα：图2I-K、PKCβ、PKCγ：图S1D). 与ITRACK相比，IDOCKS显示PKC活性上升阶段和下降阶段的动力学稍慢。在触发下一个谷氨酸去钙脉冲之前，它并没有完全回到基线，而是在去钙序列完成之前达到一个稳定状态(图2K,S1D系列). 这反映在未缓存触发平均值中，作为较高的初始值(图2L). 应注意，IDOCKS中使用的假底物不能磷酸化，因此传感器报告的衰变动力学可能比内源性底物慢。与ITRACK的测量结果一致，PKCα的激活程度大于PKCβ或PKCγ(图2L,第1d条).

几个对照实验验证了在可塑性过程中PKC活性的这些测量结果。在不使用MNI-谷氨酸或使用阴性对照传感器ITRACKneg或IDOCKSneg的情况下进行的实验表明，在sLTP诱导期间PKC活性没有变化(图S1E、F). 传感器响应的大小与传感器的表达水平无关(图S2A)或其成分的比率(图S2B). 基础传感器信号也与脊椎大小和脊椎或树突的表面积体积比无关(图S2C、D). ITRACK和IDOCKS传感器的表达，特别是IDOCKS-传感器中使用的假底物的表达，有可能干扰PKCα定位或信号传递。因此，我们通过测量标记PKCα的光活化GFP（paGFP）的荧光衰减来监测PKCα在脊椎中的扩散。光活化的paGFP PKCα以约5秒的时间常数扩散出脊柱，与PKCα的胞浆分布一致，尽管它明显慢于单独的paGFP(图S2E). ITRACK受体（CAAX）或IDOCKS受体（假底物）的共表达没有改变PKCα的扩散(图S2F)表明它们对PKCα的定位几乎没有影响。此外，表达ITRACK或IDOCKS的受刺激脊髓的sLTP与仅表达eGFP的脊髓一致(图S2G)证明传感器过度表达对内源性信号的任何影响都是最小的。最后，ITRACK和IDOCKS以及使用替代膜靶向结构域（H-Ras衍生CAAX）的ITRACK-传感器变体都产生了类似的结果，表明我们的传感器报告的PKC生理活性受到传感器设计的最小调节(图S2H).

PKCα是结构可塑性所需的唯一经典PKC同工酶

我们的测量结果表明，经典的PKC同工酶仅在sLTP诱导期激活。因此，我们通过应用广谱PKC抑制剂Gö6983来测试PKC活性在可塑性中的时间需求²⁹sLTP诱导前后。尽管Gö6983在刺激前10分钟应用时有效地阻断了sLTP，但在诱导方案后立即应用时，可塑性并未减弱(图3A-C,图S3A). 与我们的传感器测量结果一致，这些数据表明PKC活性是sLTP诱导过程中的早期信号。

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图3：

经典同工酶PKCα而非PKCβ或PKCγ调节结构可塑性

A） 在无CTL或PKC抑制剂Gö6983（Gö，1μM）预处理的情况下，单棘（箭头）无钙诱导sLTP的代表性强度图像（eGFP）。

B） 在CTL或Gö6983处理的切片中，谷氨酸去壳（黑方块）诱导sLTP的平均时间进程。应用了Gö6983 10⁺在（Gö_pre）前分钟或（Gö_post）后立即（n[神经元/棘]：CTL=11/11，Gö_pre=12/12，Gö_post=4/4）。药物应用的双向方差分析显著（F（2480）=45.35，p<0.001）。显示平均值和SEM（阴影）。

C） B（n[神经元/脊髓]：Veh=4/4）持续sLTP（25–30分钟）的量化。用Sidak的多重比较测试Gö_pre与所有其他组进行单向方差分析。显示平均值和SEM。

D） 经典PKC同工酶alpha的WT和KO同窝神经元中谷氨酸非激活（黑方块）诱导sLTP的平均时间进程（平均值和扫描电镜（阴影）显示，n[神经元/棘]：WT=10/21，KO=12/26，双向方差分析在PKCalpha基因型上显著（F（1920）=97.41，p<0.001），β-ns（n[神经元／棘]：WT=7/10，KO=9/14）和γns（n[神经元/棘]：WT＝8/17、KO＝10/23）。插图：平均持续sLTP的量化（25-30分钟，误差条代表SEM）。所示为未成对的双尾t检验。

E） 如图D所示，PKCαWT和KO窝友脊髓sLTP的平均时间进程与过度表达eGFP标记的PKCα、PKCβ或PKCγ的PKCβKO神经元的sLTP重叠。显示平均值和SEM（阴影）。组间双向方差分析显著（F（41900）=32.59，p<0.0001）。

F） E中平均持续sLTP（25–30分钟）的量化（n[神经元/脊髓]：WT=10/21，KO=12/26，KO+PKCα=9/21，KO+PKCβ=6/16，KO+PKCγ=6/16、单向方差分析和Sidak的多重比较测试）。

G） WT小鼠、PKCα、β、γ三重KO小鼠（TKO）、过度表达eGFP标记的PKCα或PKCβ、γ二重KO鼠（DKO）（n[神经元/脊髓]：WT=8/21，TKO=7/18，TKO+PKCα=7/17，βγDKO=5/16）神经元中平均持续sLTP的定量。误差条代表SEM。单因素方差分析与Sidak的多重比较。

在三个Ca中²⁺-敏感的PKC同工酶，PKCα活性在结构可塑性过程中特别强烈。一直以来，来自PKCα而非PKCβ或PKCγ基因敲除小鼠的海马CA1神经元显示出持续sLTP的缺陷(图3D，在25–30分钟时定量）。eGFP-标记的PKCα的急性、稀疏和突触后表达可以完全修复这种缺陷，但PKCβ或PKCγ不能修复这种缺陷(图3E、F). 这些数据揭示了同工酶之间信号传导的精细特异性，即使在敲除和过度表达的情况下也是如此(图S2B)我们传感器中使用的eGFP标记的PKC保留了其酶活性^30——32PKCβ和PKCγ不能修复PKCαKO的可塑性缺陷，这表明其他同工酶的补偿并不能掩盖功能丧失表型。为了进一步研究这一点，我们培育了缺乏所有经典PKC同工酶的三体小鼠（TKO）。TKO小鼠表现出与PKCαKO小鼠相似的sLTP损伤，eGFP-PKCα的急性、稀疏突触后过度表达也可以完全缓解这种损伤(图3G,S2C、D). 最后，PKCβ和PKCγ的双敲除（DKO）在sLTP中没有缺陷(图3G). 这些数据表明PKCα是唯一的钙²⁺-sLTP中的敏感PKC亚型。

sLTP期间PKCα的同工酶特异性由C末端PDZ结合域定义。

经典的PKC同工酶序列同源性高，体外底物特异性差，提示同工酶功能的特异性可能是由于选择性的蛋白质相互作用。PKCα唯一的一个结构域是4氨基酸（QSAV）C末端PDZ结合基序(图4A)³³为了确定该结构域是否有助于诱导可塑性过程中激酶激活的同工酶特异性，我们使用了缺少该结构域的ITRACKαFLIM传感器(图4B，PKCαΔQSAV）和ITRACKγ传感器，其中该域被添加到C末端(图4B，PKCγ+QSAV）监测WT的激活和突变PKC对谷氨酸去壳化的反应。PKCαΔQSAV易位的幅度降低到与PKCγWT相似的水平。此外，PKCγ+QSAV被更强烈地激活，达到与PKCαWT类似的水平(图4C、D).

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图4：

同工酶特异性PKCα活性和功能由C末端PDZ结合域定义

A） 经典PKC同工酶结构域示意图。PS：假底物，C1：DAG结合域，C2：钙结合域，C3：ATP结合位点，C4：底物结合域。V1–V5：同工酶之间同源性较低的区域。显示了三种经典同工酶V5的C末端部分的氨基酸序列。显示了PDZ结合基序。

B） 用于面板D-G的ITRACK传感器的eGFP标记的PKC构建体的示意图。供体构建体由eGFP标记的PKCα（WT）或没有PDZ结合结构域的缺失突变体PKCα（ΔQSAV）和PKCγ（WT）组成，或由PKCα的PDZ结合结构域添加到C末端的嵌合PKCγ（+QSAV）组成。

C） ITRACK测量的非老化触发平均值（显示平均值和SEM（阴影），n[神经元/脊髓]=PKCαWT:5/28，PKCαΔQSAV:8/39，PKCγWT:4/30，PKC伽玛+QSAV:6/35）。

D） （C、平均值和SEM）中峰值易位的量化。双向方差分析对QSAV结构域的存在显著（F（1128）=11.81，p=0.0008）。Sidak的多重比较测试。

E） 过度表达eGFP标记的PKCαΔQSAV（n[神经元/脊髓]=6/17）或过度表达eGFP标记的PKCγ+QSAV的PKC a KO神经元的脊髓sLTP的平均时间进程（n=4/13）。显示平均值和SEM（阴影）。

F） 对仅过度表达eGFP的PKCαKO小鼠（PKCαKO:n[神经元/棘]=4/12）、eGFP标记的PKC a WT（n=5/14）、PKCαΔQSAV（如E所示）、PKC-γWT（n=3/10）、PKC+QSAV。误差条代表SEM。通过QSAV域的存在，双向方差分析显著（F（1,49）=14.63，p=0.0004）。Sidak的多重比较测试。

然后，我们在PKCαKO神经元中表达这些突变结构，并监测sLTP，以确定该结构域是否决定了sLTP中PKCα的功能同工酶特异性。PKCαΔQSAV不能挽救PKCαKO动物的sLTP缺陷，类似于其他PKC同工酶的表达(图4E、F). 另一方面，PKCγ+QSAV的表达完全挽救了PKCα-KO sLTP缺陷(图4E、F). 这表明在功能上，PKCαC末端PDZ结合域的存在或缺失足以解释其同工酶特异性在sLTP中的作用。

PKCα是功能可塑性和空间学习所必需的

为了评估PKCα在其他突触可塑性测量中是否发挥中心作用，我们对PKCαKO动物进行了电生理LTP测量。而PKCαKO小鼠的基础传播无明显差异(图5A)与非转基因窝鼠相比，高频电刺激对Schaeffer侧支突触的LTP诱导严重受损（3×100 Hz 1s序列刺激，图5B、C).

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图5：

PKCαKO动物可塑性的功能和行为特征

A） 电生理记录显示PKCαKO（n[动物/实验]=8/20）和WT（n=8/20）同窝小鼠的平均输入/输出曲线。显示平均值和SEM。

B） PKCαKO（n[动物/实验]=8/22）和WT（n=8/19）同窝小鼠CA1锥体神经元LTP诱导前后细胞外记录的EPSP斜率和平均代表性EPSP轨迹（插图）变化的时间进程。显示平均值和SEM。基因型的双向方差分析显著（F（28818）=463.7 p<0.0001）。

C） 量化（B）中神经元的平均增强（40–60分钟）。显示平均值和SEM。双尾非配对t检验。

D） 雄性PKCαKO（n[动物]=13）和WT（n=15）同窝小鼠在高架迷宫中的焦虑相关测量（平均值和SEM）。显示平均值和SEM。双尾非配对t检验。

E） 提示性和情境性恐惧条件作用下PKCαKO和WT室友的移动距离和冻结时间百分比。显示平均值和SEM。双尾非配对t检验。

F） 莫里斯水迷宫（MWM）的训练和测试方案示意图。

G） 在PKCαKO（n[动物]=13）和WT（n=15）同窝出生小鼠的训练过程中，在MWM任务中发现隐藏平台的成功和延迟的获取曲线（成功发现平台的双向重复测量ANOVA按天数显著（F（10260）=26.67，p<0.0001）和基因型（F（1,26）=8.302，p=0.0078），对于潜伏期，发现平台显著（F（9234）=19.5，p<0.0001）和基因型（F（126）=5.11，p=0.0324）。每天对动物进行训练，直到它们达到组平均性能标准（虚线：成功找到平台>95%，到平台的延迟<20秒）。显示平均值和SEM。黑点表示平台的位置。黑色三角形表示用于评估学习的探究测试。

H） 反转训练第3天（D16）后，WT（n[动物]=15）和PKCαKO（n=13）小鼠在探针测试的前30秒的平均象限时间、距平台位置的距离和热图。显示平均值和SEM。通过双向重复测量ANOVA分析象限时间，显示位置和基因型之间存在显著交互作用（F（3104）=5.97，p=0.0009）。Sidak按地点进行的基因型多重比较试验在目标象限中具有显著性。通过非配对双尾t检验分析与平台位置的距离。

一） 在达到反向训练性能标准后的第1天、第4天和第40天进行记忆探针测试时，PKCαWT（n[动物]=15）和KO小鼠（n=13）与训练平台位置的平均距离。显示平均值和SEM。未配对双尾t检验（ns）。

接下来，我们评估PKCαKO动物是否具有可能与突触可塑性缺陷相关的行为表型。通过野外测试评估，WT和PKCαKO窝友（男性，分别为15、13、9-16周）在运动或焦虑方面没有差异(图S4A)，通过自发交替任务评估的工作记忆(图S4B)或通过热板测试评估的伤害(图S4C). PKCαKO动物在高架正迷宫中表现出轻度焦虑表现，因为它们花费的时间显著减少，进入开放臂的次数也更少(图5D，未配对t检验）。在线索和情境恐惧条件化任务中，WT和KO动物对条件化线索的反应类似(图5E，提示）。然而，PKCαKO动物表现出比WT动物更少冻结的趋势，并且在条件化环境中移动明显更多(图5E，上下文）。这些结果表明海马依赖性空间学习或记忆可能受损。

通过Morris Water Maze任务对海马依赖性空间学习和记忆进行更详细的评估(图5F). WT和KO动物在视觉平台训练和隐藏平台任务训练的第1天表现同样好(图5G). 然而，KO动物在学习获得方面表现出延迟，需要两天的时间才能达到预定的小组表现标准(图5G). 然而，一旦达到学习标准，PKCαWT和KO动物在训练后1天和4天的记忆探针测试中表现出相似的表现。为了进一步调查潜在的学习缺陷，重复进行MWM培训，将平台位置反转至相反象限。在逆转训练的第二天和第四天进行了探针测试。在这些探针测试中，PKCαKO动物与WT同窝动物相比，对平台位置的学习能力受损(图5H). 象限时间分析显示，到反转第4天，WT动物在目标象限的时间显著延长，而KO动物在所有四个象限的花费时间相同(图5H，左）。WT动物与平台位置的平均距离也显著小于KO动物(图5H，中间）。这些差异反映在WT和KO动物的群体平均热图中(图5H，右侧）。与较慢的学习速度一致，KO动物达到小组绩效标准的时间也比WT动物长三天(图5G). 然而，在达到标准后1、4或40天，WT和KO动物的记忆探针测试没有差异(图5I). 这些结果表明，PKCαKO动物在学习方面存在缺陷，这与它们在脊柱结构和功能可塑性方面的缺陷一致。

脊柱可塑性过程中NMDAR和TrkB的激活汇聚激活PKCα

在确定了PKCα在突触可塑性和学习中的关键作用后，我们接下来研究了在可塑性期间激活PKCα的上游信号。为此，我们测量了药物操作前后对塑性诱导刺激的PKCα活性(图6A). 首先，我们发现用AP5（50μM）抑制NMDA受体阻断了sLTP的诱导以及ITRACK测定的PKCα的激活(图6B、G,5安)表明Ca²⁺通过NMDAR的通量是PKCα活化所必需的。经典PKC需要两个Ca²⁺和脂质信号（二酰甘油（DAG））被激活。因此，我们在应用去甲磺酸（50μM）前后测量了PKCα易位和底物结合，去甲磺酸是磷脂酰肌醇定向磷脂酶C（PLC）的抑制剂，可产生DAG。Edelfosine显著降低PKCα活化和结构可塑性(图6C、G,S5A、B类)表明DAG的产生有助于PKCα在塑性过程中的活化。这一发现通过使用第二种PLC抑制剂U73122（10μM）得到了证实，该抑制剂可破坏PKCα的易位(图6G,S5C系列). PLC上游并被谷氨酸激活的一条潜在信号通路是I组代谢型谷氨酸受体（mGluRs），它通过Gαq发出信号来激活PLC。然而，用竞争性或非竞争性拮抗剂S-MCPG（250μM，图6D、G,5安)和NPS 2390（20μM，图6G,S5A、D)对PKCα易位或结构可塑性无影响。

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图6：

NMDAR和BDNF/TrkB激活聚合以激活PKCα

A） 用于抑制信号通路各种成分的药理制剂示意图。

B-E）用药前后未老化引发的PKCα活性平均值（用ITRACKα测量）。显示平均值和SEM（阴影）。B） APV（50μM n[神经元/脊髓]=6/26，CTL 6/15）。C） Edelfosine（50μM n[神经元/脊椎]=7/29，CTL 7/23）。D） MCPG（250μM n[神经元/棘]=7/23，CTL 7/23）。E） 1纳米PP1(TrkB公司^F616A型老鼠；1μM 1NMPP1 n[神经元/棘]=7/27，CTL=11/40，Veh=4/17）。显示了双尾非配对t检验的重要性。

F） 非casging触发的神经元PKCα活性平均值的平均变化（用ITRACKα测量）Bdnf公司 ^{飞行/飞行}用Cre表达ITRACKα的小鼠（n[神经元/棘]=14/49）或不表达Cre的小鼠（CTL n[神经元／棘]=10/35）。显示平均值和SEM（阴影）。Cre治疗的双向方差分析显著性。

G） 通过PKCα激活的指示处理的平均抑制百分比的量化（与B-F中的数据相同，图S5C、D). 每个处理中ITRACKα的峰值响应（t=0.192 s）归一化为其自身的对照实验（NPS 20μM n[神经元/棘]=7/28，U73122 10μM n[neurons/棘]=3/9）。误差线反映了治疗组和对照组平均值的组合标准误差。显示了双尾单样本t检验对100%的显著性。

接下来我们测试了BDNF/TrkB通路的参与，这是一种激活PLC的典型可塑性促进信号通路^34,35为了在诱导可塑性的过程中选择性地抑制TrkB，我们利用了TrkB公司^F616A型敲除小鼠³⁶这些小鼠具有正常的TrkB功能，可被药物1NMPP1选择性抑制。刺激期间TrkB的阻断抑制PKCα易位和底物对接以及sLTP，其程度与抑制PLC相似(图6E，G,S5A、E). 最近的研究表明，在sLTP诱导过程中，突触后BDNF可以快速释放，以响应来自受刺激脊椎的每一个谷氨酸非激活脉冲，激活同一脊椎中的TrkB并招募PLC³⁷为了确定这种自主信号机制是否有助于PKCα在可塑性过程中的激活，我们使用漂浮BDNF敲除小鼠敲除单个神经元中BDNF的表达(Bdnf公司 ^{飞行/飞行})Cre重组酶的稀疏表达。脊髓可塑性过程中BDNF单细胞突触后敲除损伤PKCα活性(图6F、G)，证明自分泌BDNF/TrkB信号是PKCα活性的上游。然而，我们不能排除BDNF的其他来源（例如突触前）也可能在突触刺激期间促进突触后TrkB的激活。综上所述，这些结果表明，PKCα通过受刺激脊柱中两条通路的汇合激活：NMDARs激活和BDNF-TrkB自分泌激活，这两条通路提供钙²⁺和DAG。

HeLa细胞维护、转染和成像：

HeLa细胞（ATCC CCL-2）在添加10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中培养，37 5%CO中的°C₂并使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染各种质粒。对于HeLa细胞，ITRACK以供体质粒与受体质粒的比例1:3转染。对于IDOCKS，编码供体和受体的质粒比例为1:2。在HEPES缓冲aCSF溶液中转染2 mM CaCl后24–48小时进行成像₂和2 mM氯化镁₂由2pFLIM执行，如下所述。当需要时，用1μM PdBu（Tocris）刺激细胞，然后在2.5分钟后用1μM-Ionomycin（Tocrus）或DMSO（0.02%）载体刺激细胞。

动物：

根据美国国立卫生研究院的指导方针，所有实验程序均由马克斯·普朗克佛罗里达神经科学研究所动物护理和使用委员会批准。将来自两性的P3–P8小鼠幼崽用于成像研究的器官型切片。将两性P30–P50小鼠用于急性切片进行电生理研究。使用2-4个月大的雄性小鼠进行行为研究。

• 非转基因动物C57Bl/6N Crl来自Charles River实验室。
• -如前所述，PKCαKO 129/sv和PKCβKO 129/sv动物由Michael Leitges博士培育^52,53动物被杂交到C57Bl/6N Crl，背景混合。在所有实验中，WT窝友被用作KO动物的对照。
• -如前所述，PKCγ-KO动物由Susumu Tonegawa博士培育⁴⁶并从Jackson Labs B6收到；129P2-Prkcgtm1Stl/J库存编号：002466。将动物与C57Bl/6N Crl杂交，并在混合背景下。在所有实验中，WT窝友被用作KO动物的对照。
• -双（β，γ）基因敲除和三（α，β，γ。繁殖对在一个或两个基因上为KO，在其余基因上为Het。培育了一个平行的WT对照系，以按品系和世代匹配后代。
• -TrkB^F616A型如前所述，由David Ginty博士开发并提供C57bl/6突变小鼠³⁶.
• -BDNF^{飞行/飞行}如前所述，由Luis Parada博士开发并提供C57bl/6小鼠⁵⁴.

器官型海马片培养和转染：

如前所述，从野生型或转基因出生后3-8天的雄性幼鼠中制备器官型海马切片⁵⁵简言之，用异氟醚深度麻醉对幼犬实施安乐死，然后斩首。移除大脑后，解剖海马，使用McIlwain组织切碎器（Ted Pella，Inc）切割350μm厚的冠状海马切片，并将其镀在亲水PTFE膜上（Millicell，Millipore）。切片保存在含有MEM培养基（Life Technologies）、20%马血清、1mM L-谷氨酰胺、1mM CaCl的培养基中₂，2mM硫酸镁₄，12.9mM D-葡萄糖，5.2mM NaHCO_三、30mM肝素、0.075%抗坏血酸、1μg/ml胰岛素。介质每隔一天交换一次。在培养7–10天后，CA1锥体神经元被生物基因转染⁵⁶使用1.0或1.6μm金珠（8–12 mg）包被含有以下数量的感兴趣DNA的质粒。mEGFP:15μg ITRACK或ITRACKneg：15μg供体（mEGFP-PKCα、PKCβ-mEGFP或mEGFP-PKCγ）40μg受体（mCh-CAAX或mCh-CAAX_neg）。IDOCKS或IDOCKSneg:10μg供体（PKCα-mEGFP、PKCB-mEGFP/或PKCγ-mEGFP-）20μg受体（2mCh-PS或2mCh-PSmut）。Cre重组酶：含或不含ITRACK DNA的10μg Cre。以与ITRACK和IDOCKS相同的比例转染光活化结构体和PDZ结合域突变结构体。对转染CA1锥体神经元放射层中的二级或三级顶端树突进行成像3-7 2pFLIM转染（对于PKC传感器）后第天，如下所述。

2光子显微镜和2pFLIM:

使用2pFLIM测定PKC同工酶活性。为了量化脊椎体积变化，我们使用常规双光子显微镜监测脊椎中mEGFP的荧光强度变化，该显微镜与寿命测量同时进行。如前所述，使用定制2p显微镜对HeLa细胞和切片进行强度测量和2pFLIM成像⁵⁷简单地说，mEGFP和mCh是用波长为920的钛宝石激光器（变色龙，相干）激发的 在物镜下方测得的功率为1.4–1.6 mW。用物镜（60×，1.0 n.a，Olympus）收集荧光，并用二色镜（565 nm），并用放置在波长滤光片后的两个分离的光电子倍增管进行检测（Chroma，510/70–2p代表绿色，620/90–2p表示红色）。红光和绿光通道均使用低传输时间扩展（H7422–40p；哈马松）的光电倍增管。使用PCI-6110（National instrument）采集荧光图像，并在Matlab的ScanImage 3.8上显示⁵⁸使用时间相关单光子计数板（SPC-150；Becker和Hickl）获得荧光寿命图像，该计数板由Matlab中的自定义软件控制²⁴用128×128像素采集用于sLTP体积变化分析的强度图像，作为三个切片的z叠加，间隔1μm，平均5帧/切片。脊椎体积变化计算为背景减去F-F₀其中F₀是刺激前的平均荧光强度。在许多sLTP体积成像的情况下，通过使用自动聚焦和漂移校正算法来保持位置和焦点，使用MATLAB中定制的界面对每个神经元的4个棘进行并行自动成像^59——61。合并了2分钟的未缓存事件交错，以避免在未缓存事件期间丢失数据。FLIM成像由32×32像素以128 ms/帧的速度采集，时间分辨率为7.8 Hz。未平均帧数。为了对FLIM数据进行空间分析，以128ms/帧的速度采集64×64像素的图像。未平均帧数。

双光子谷氨酸开盖：

使用调谐波长为720nm的Ti:Sapphire激光，在距脊椎0.5μm的小范围内，以30脉冲、0.5 Hz的序列，在距离脊椎约0.5μm处，对4-甲氧基-7-硝基吲哚啉-谷氨酸（MNI-笼状谷氨酸，Tocris）进行开盖，诱导树突脊椎的结构可塑性。在物镜处测得的激光功率设置为2.7 mW。对于塑性诱导实验，根据受刺激脊椎的深度设置非切割脉冲的宽度（深度小于10μm的脊椎为4ms，深度介于10-20μm之间的脊椎6 ms，深度介于20-50μm的脊柱8 ms）。未选择深度超过50μm的脊柱进行开盖实验。实验用镁进行²⁺人工脑脊液（ACSF；127 mM NaCl，2.5 mM KCl，4 mM CaCl₂，25 mM NaHCO_三，1.25 mM NaH₂人事军官₄和25 mM葡萄糖），含有1μM河豚毒素（TTX）和4 mM MNI-笼式L-谷氨酸盐，用95%氧气充气₂和5%CO₂。实验在室温（24–26°C）下进行。对于异突触促进实验，选择深度在5μm到25μm之间的棘。未配对的脊髓在5μm内与给定神经元上的配对脊髓深度匹配。通过将非鞘化激光停留时间更改为1ms，进行阈下刺激。超阈值刺激的停留时间为4、6或8 ms，具体取决于上述深度。”首先给予未成对的阈下刺激，分布在不同的树突上（每个神经元约4个）。随后，在10μm以外的脊椎诱导sLTP后3-4分钟，给予“配对”阈下刺激。

钙成像以及钙和FLIM传感器的同步成像：

对于响应谷氨酸盐的钙成像，用CMV驱动的GCaMP6f和CMV驱动的mCyRFP转染未封壳的器官型切片⁶²以64ms的时间分辨率监测强度。在可塑性诱导后，脊椎体积增加，因此GCaMP6f因体积变化而标准化为mCyRFP强度增加。对于同时进行FLIM和钙成像，荧光寿命测量以及强度图像如上文所述。使用jRGECO1a通过1100 nm、120fs脉冲、80MHz双光子INSIGHT激光（光谱物理）激发的通道2中的强度测量钙成像。对于这些实验，需要修改ITRACK受体结构，以避免钙成像通道受到污染。因此，mCh荧光团被ShadowY取代，这是一种基于YFP的暗荧光团。通过生物列表法将切片转染成以下混合结构：含有15μg供体（mEGFP-PKCα）40μg受体（ShadowY-CAAX）和15 ug jRGECO1a的sY-ITRACKα。注意避免对阴影Y表达特别高的神经元成像，阴影Y表达可以通过其短寿命检测到。为了分析成对脊髓，在进一步分析PKCα活性或钙内流之前，监测成对脊髓的体积变化，以确保成功诱导异突触可塑性。如下所述对FLIM数据进行分析。由于sLTP导致脊柱体积增加，jRGECO1a的强度变化被归一化。

2pFLIM分析：

为了测量正在接受FRET的供体与受体的比例（%移位或%基板对接），我们拟合了荧光寿命曲线，用与高斯脉冲响应函数卷积的双指数函数求出整个图像上所有像素的总和：

其中τ_AD公司是施主与受体结合的荧光寿命，P（P）_天和P（P）_AD公司分别是游离供体和供体与受体进行FRET的分数，以及H（H）(t吨)是荧光寿命曲线，具有与高斯脉冲响应函数卷积的单指数函数：

其中τ_天是自由施主的荧光寿命，τ_G公司是高斯脉冲响应函数的宽度，F类₀是卷积前的峰值荧光t吨₀是时间偏移，erfc是互补误差函数。

我们得到了τ_天从单指数拟合(P（P）_AD公司=0）到HeLa细胞中表达的mEGFP-PKCα的荧光寿命曲线（2.65 ns），然后得到τ_AD公司通过双指数拟合HeLa细胞中传感器（ITRACK或IDOCKS）在强PKC激活剂（1.33ns）刺激下的荧光寿命曲线。对于实验数据，我们固定了τ_天和τ_AD公司以获得稳定的拟合。为了生成荧光寿命图像，我们计算了平均光子到达时间<t吨>，在每个像素中为：

然后，通过偏移到达时间，平均光子到达时间与平均荧光寿命<τ>相关，t吨_o个，通过拟合整个图像获得：

参与FRET的PKC同工酶的分数根据获得的<τ>计算为：

移位或基质对接的变化计算为P_AD公司–P_AD0公司其中P_AD0公司是平均P_AD公司在刺激之前。在进一步分析之前，排除了基线寿命波动大于.1 ns的数据。分析中纠正了寿命漂移。

药理学实验：

对每个神经元进行配对的所有药理实验。在同一神经元中，用药前后均能诱导脊髓的结构可塑性。1NMPP1（Santa Cruz，WD 1μM）在DMSO中制备为10 mM储备液，然后在溶解缓冲液（0.9%NaCl和2.5%吐温-20）中稀释至500倍。U73122和{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“U73343”，“term_id”：“1688125”，“term_text”：“U73343“}}U73343型（Tocris，μM按照供应商的建议进行储存，并稀释至CSF中列出的工作稀释液（WD）。

电生理学：

急性切片制备：PKCαWT或KO同窝小鼠（P30–P50）通过吸入异氟醚镇静，并用冷冻氯化胆碱溶液进行心内灌注。将大脑取出并置于由124 mM氯化胆碱、2.5 mM氯化钾、26 mM氯化钠、3.3 mM氯化镁组成的氯化胆碱溶液中₂、1.2 mM NaH2PO4、10 mM葡萄糖和0.5 mM CaCl₂，pH 7.4与95%O2/5%CO2平衡。使用震动器（徕卡）切割含有海马的冠状切片（400μm），并将其保存在32°C的水下室中1h，然后在室温下保存在含氧ACSF中。

细胞外记录和LTP协议：用含2 mM CaCl的充氧ACSF灌注切片₂，2 mM氯化镁₂和100μM苦毒毒素。将一个含有相同ACSF溶液的玻璃电极（电阻约为4 MΩ）放置在CA1区的树突层（距胞体约100–200μM）中，同时使用同心双极刺激电极（FHC）用电流平方脉冲（0.1 ms）刺激Schaffer侧支纤维。使用定制软件（MatLab）监测EPSP的初始坡度。刺激强度设置为约50%的饱和度。LTP是通过以20s的间隔施加3组高频刺激（100Hz，1s）来诱导的。所有数据都是用Matlab编写的内部程序进行分析的。数据表示为平均值±SEM。

动物行为：

致谢：我们要感谢执行动物行为研究的A.F.Brantley和Scripps Florida行为核心路易斯·帕拉达（纪念斯隆·凯特琳）Bdnf公司 ^{飞行/飞行}老鼠，David Ginty（哈佛）TrkB公司^F616A型小鼠、M.Dowdy和动物护理MPFI ARC、安田实验室成员、L.Yan和D.Kloetzer。这项工作由F32MH101954（LAC）、R01MH080047（RY）、1DP1NS096787（RY）和马克斯·普朗克佛罗里达神经科学研究所资助。