MLL1对表观基因组的重新编程将早期环境暴露与前列腺癌风险联系起来

试剂和抗体

17β-雌二醇（E2）、17β-雌激素6-（O-羧甲基）肟：BSA，也称为BSA-共轭雌二醇（E_2-BSA）、胰岛素和PI3K抑制剂LY294002购自Sigma-Aldrich。识别磷酸化AKT（S473）、AKT、磷酸化S6（S235/236）、S6或组蛋白H3的抗体购自Cell Signaling Technology。识别GRB2的抗体购自Santa Cruz Biotechnology，Inc.。识别MLL1 C和N末端的抗体购于Millipore。识别H3K4Me3和组蛋白H3赖氨酸9乙酰化（H3K9ac）的抗体从Active Motif购买。识别MLL2的抗体是Ali Shilatifard博士慷慨赠送的礼物。

动物和双酚A治疗

6-8周龄的Sprague-Dawley大鼠从哈兰购买，并按照MD Anderson癌症中心动物护理和使用委员会的指导方针进行饲养，并作为繁殖者生产本研究所需的大鼠。为了确保大鼠不暴露于外源性外源性雌激素，它们被关在无聚碳酸酯笼中，并被随意喂食植物雌激素减少饮食（Zeigler Bros，Inc）。将大鼠维持在14小时的光照、10小时的黑暗循环中。为了增加12个月大鼠前列腺上皮内瘤变（PIN）的发生率，动物出生后（d 1-5）暴露于BPA，并在出生后第70天（d）用睾酮（T）加雌二醇（T+E）进行激发，如前所述(23). 简言之，BPA（由NIEHS提供）溶于芝麻油中，并于第1天、第3天和第5天通过参考sc剂量（每个剂量为10-μg/kg体重（BPA10））或口服剂量（每个浓度为50-μg/kg重量（BPA50））给新生儿服用。载体治疗组口服麻油。如前所述(23)为了促进致癌，大鼠从第70天开始植入1粒含雌二醇（E）的胶囊（1厘米管；内径1.5毫米，外径2毫米）和2粒含T的胶囊（2厘米管）（道康宁）；每2个月更换一次胶囊。12个月大时，处死每只动物，迅速取出前列腺，用10%中性缓冲福尔马林固定，并保存在70%乙醇中，用于组织病理学诊断和免疫组织化学染色。载体治疗组也植入激素胶囊，作为BPA治疗动物的同龄对照。

此外，我们收集了d6和d70动物的前列腺样本；用d6前列腺测定BPA暴露的急性反应；取d6载体、BPA10和BPA50动物的整个前列腺进行RNA分离、染色质制备和Western blot分析。用载体（芝麻油）治疗的动物作为BPA治疗动物的同龄对照。为了分析新生儿BPA暴露对基因表达和表观基因组的长期影响，在第70天（激素植入前），从暴露于载体和BPA的动物中取出整个前列腺，进行RNA测序（RNA-seq）和染色质免疫沉淀（ChIP）测序（ChIP-seq）。未植入激素的车用治疗动物作为未植入激素BPA治疗动物的同龄对照。为了确定重组动物中激素反应的基因表达是否发生改变，用油（O）（V-O，BPA-O；注射芝麻油）或激素（H）（V+H，BPA+H；注射5 mg/kg T和0.25 mg/kg雌二醇）对出生后接触载体（V）和BPA的动物进行激发。给药6小时后收集前列腺组织，分离前列腺叶进行RNA分离和染色质制备。对于d6动物，每个样本共收集6个新生儿前列腺，对于d70动物，将侧前列腺分成两半，用于随后的实时定量PCR（qPCR）分析。补充表1和2总结我们实验设计的细节，包括哪些前列腺叶以及使用了多少动物进行概述的研究。

RNA-seq和定量实时RT-PCR（RT-qPCR）

如前所述，为了确定BPA靶向的发育重编程基因，对d70全前列腺进行了全基因组转录组测序和数据分析(23). 简单地说，总RNA被分离出来，cDNA文库是使用SPRI-works Fragment Library System I（Beckman Coulter）构建的。在PCR富集和纯化后，将10pM DNA加载到cBOT上的成对末端流动细胞中以生成簇，然后加载到HiSeq 2000测序器（Illumina，Inc）上以生成单个36-bp序列读取。使用TopHat对准器将序列读数与大鼠参考基因组（rn4；BCM HGSC 3.4版）进行比对。使用ShortRead和相关的Bioconductor包汇总对齐读取计数。使用阴性肿瘤模型进行统计分析，以确定BPA治疗的动物和新生期接触载体的年龄匹配（d70）大鼠之间差异表达的基因。错误发现率已调整P（P）值用于控制多次测试。错误发现率小于0.1的基因和P（P）<.01被认为是显著差异表达的。对于qPCR，使用RiboPure RNA纯化试剂盒（Life Technologies）分离总RNA，并根据制造商的协议使用SuperScript III第一链合成系统（Life Technologies）进行cDNA合成。使用快速SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems）和Viia7 RT-PCR系统（Life Technologies）实时PCR测量mRNA水平。RT-qPCR引物设计为跨越外显子-外显子边界，所有引物序列列于补充表3通过δ-δ循环阈值法，根据阈值周期差异计算基因表达的折叠变化。

ChIP、ChIP-seq和qPCR

根据制造商的方案，使用ChIP试剂盒（EZ-Magna ChIP；Millipore）从前列腺组织制备染色质。简单地说，前列腺组织在添加蛋白酶抑制剂的冰镇PBS中切碎，然后用1.5%甲醛交联组织，用125mM甘氨酸孵育，并用冷却的PBS清洗。清洗后，前列腺组织均质，离心，再悬浮在细胞溶解缓冲液中（5mM哌嗪-N，N′双[pH8]、85mM KCl和0.5%Nonide P-40），并浸泡。旋转样品，将组织沉淀重悬于核裂解缓冲液（50mM Tris-HCl[pH 8.1]、10mM EDTA和1%十二烷基硫酸钠（SDS））中。为了从HEK293细胞或MCF-7细胞中制备染色质，用1%甲醛处理细胞，使蛋白质与DNA交联；然后用125mM甘氨酸孵育细胞并用冷冻PBS洗涤。离心后，将细胞重新悬浮在细胞裂解缓冲液中（PBS中含有0.5mM EDTA和0.05%Triton X-100），并通过离心收集。将每个细胞颗粒重新悬浮在核溶解缓冲液（50mM Tris-HCl[pH8.1]、10mM EDTA和1%SDS）中。用生物破坏者（Diagenode）对前列腺组织和细胞系的染色质制剂进行超声波处理，以获得包含100–500 bp的片段。根据Magna ChIP套件的说明执行ChIP。然后使用Fast SYBR Green Master Mix和下列引物对通过ChIP分离的DNA进行qPCR分析补充表4结果显示为与抗H3K9ac、抗H3K4me3、抗MLL1 C末端或对照抗体共沉淀的输入DNA的百分比（%输入）。

对于ChIP-seq数据分析，使用Illumina CASAWA软件对ChIP实验中的序列读取进行解复用并转换为fastq文件。得到的FASTQ文件首先与使用bwa进行RNA-seq数据分析时使用的相同参考大鼠基因组对齐(24)，以创建包含对齐信息的BAM文件。基于模型的ChIP-seq分析(25)然后应用于识别不同组蛋白标记IP样品相对于相应输入的峰值。在ChIP-seq峰值调用过程的基于模型的分析中，使用了上一步的对齐BAM文件，褶皱富集参数的下限和上限分别设置为4和30。

细胞培养和治疗

雌激素应答的MCF-7细胞系和胰岛素应答的HEK293细胞系分别对雌激素或胰岛素表现出强烈的非基因组（PI3K）信号激活，因此被用作检测PI3K/AKT介导的MLL激活的模型。用改良MEM（Invitrogen）和10%胎牛血清（HyClone Laboratories）维持MCF-7细胞。在E2处理之前，MCF-7细胞在无血清、无酚红培养基中饥饿48小时。为了确保E2-BSA储备溶液不含游离雌激素，将结晶E2-BSA溶解在PBS中，并按照前面所述进行纯化(26). 用补充10%胎牛血清的DMEM维持HEK293细胞。在胰岛素治疗前，HEK293细胞在无血清培养基中饥饿24小时。为了抑制PI3K通路，在E2给药前用LY294002（20μM）预处理MCF-7或HEK293细胞1小时。

蛋白质印迹分析

对于蛋白质收集，用PBS洗涤细胞两次，然后用裂解缓冲液（20mM Tris-HCl[pH7.5]，1mM EGTA，1mM Na₂EDTA、150mM NaCl、1mMβ-甘油磷酸、2.5mM焦磷酸钠、1%Triton、1mM Na_三VO（旁白）₄、1mM苯甲基磺酰氟、1mM NaF和完整蛋白酶抑制剂鸡尾酒[罗氏应用科学]）。然后将裂解物以13000离心克在4°C下持续15分钟，收集每个上清液。使用Pierce BCA蛋白质检测试剂盒（Pierce Biotechnology）测定蛋白质浓度。用SDS-PAGE（Bio-Read Laboratories，Inc）分离每个裂解液中的蛋白质，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。与一级抗体孵育后，用含吐温20的Tris缓冲盐水清洗膜，并暴露于适当的辣根过氧化物酶偶联二级抗体（Santa Cruz Biotechnology，Inc）；用Pierce ECL蛋白质印迹底物（Pierce Biotechnology）或ECL plus（GE Healthcare Bio Sciences Corp）检测免疫印迹信号。

用PBS冲洗来自d6新生儿的前列腺组织两次，并在组织溶解缓冲液（10mM Tris-HCl[pH7-7.4]，10mM NaCl，3mM MgCl）中溶解₂，1mM苯甲基磺酰氟，1mM钠_三VO（旁白）₄、1mM NaF和全蛋白酶抑制剂鸡尾酒），含0.5%Nonide P-40；然后在冰上培养每种裂解物30分钟，并在13000下离心15分钟克温度为4°C。如上所述，收集上清液并用于细胞溶质非基因组信号的Western blot分析。为了获得用于Western blot分析的组蛋白富集裂解物，将每个离心颗粒重新悬浮在0.1N HCl中，并在4°C下培养。

短发夹RNA（shRNA）序列、慢病毒制备和细胞感染

为了确定甲基转移酶对响应BPA的H3K4me3变化的特异性，甲基转移酶的稳定敲除MLL1、MLL2和赖氨酸特异性甲基转移酶2F(KMT2F/SET1A)和蛋白酶Taspase任务1使用shRNA慢病毒（pLKO.1-puro）质粒（Thermo Scientific）进行表达。shRNA靶序列列于补充表5将293T细胞置于10 cm培养皿中，用pLKO.1-puro质粒（6μg）和慢病毒包装载体构建物Vsvg（4.5μg）以及PAX2（3μg）与Lipofectamine 2000共转染。转染后约6小时更换培养基，再培养48小时，然后收集培养基并通过0.45-μm过滤器过滤。将MCF-7细胞与含病毒培养基在6孔板中孵育过夜，更换培养基，并孵育细胞24小时。将细胞转移到10-cm培养皿中，并通过在嘌呤霉素（4μg/mL）中培养10天来选择转导的细胞。

免疫组织化学定量分析

用Vectra系统（PerkinElmer，Inc）采集免疫组织化学标本的图像。使用Vectra仪器附带的inForm软件对每张图像进行分类和评分。inForm算法经过训练以区分不同的细胞类型，并提供目标蛋白表达的量化读数。

H3K4me3增加增强发育重编程基因的激素反应性

关注参与KEGG前列腺癌途径的基因(网址：http://www.kegg.jp)，来自载体和BPA暴露大鼠的ChIP-seq数据显示，在BPA暴露前列腺的转录起始位点（TSS），H3K4me3在该途径中的几个基因显著而显著地富集(图2A） 。信号转导相关基因的H3K4me3水平升高(组2,Igr1r抗体,Nfkbia公司,地图2k2,地图3,Pdpk1型，以及Ikbkb公司)，肿瘤发生(埃尔布2,Pdgfb公司，以及赫拉（Hras）)，细胞周期(抄送1)和蛋白质折叠(热休克蛋白90ab1). 为了验证这些ChIP-seq数据，使用抗H3K4me3抗体进行了ChIP-qPCR，这证实了这些基因中11/12个在TSS处H3K4me3的预期增加，其中9个达到统计显著性(表2)；在定位于这些基因TSS上游区域的H3K4me3中，BPA和车辆暴露前列腺之间没有观察到差异，这些基因作为对照来证明H3K4me3富集的特异性(表2).

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图2。

BPA对KEGG前列腺癌途径基因的重新编程。A、 具有代表性的ChIP-seq基因组浏览器对12个KEGG通路基因H3K4me3占有率的看法。结果来自2个生物复制品。B、 左图，KEGG通路基因的基因表达组2采用RT-qPCR检测d70侧前列腺；19卢比用作内部对照，以确定相关基因表达。治疗组如下：出生后V-O、出生后V+H、出生后BPA-O和出生后BPA+H。点图显示每个样本的折叠变化。水平线表示中值，n=3。使用单向方差分析确定显著性；*，P（P）<0.05。右图，载药和BPA10治疗的12个月大的动物前列腺侧叶切片中GRB2表达的代表性图像（棕色）（所有大鼠均植入d70含T和E的胶囊）。主要图像：放大倍数，×400；插图，放大倍数，×100。最右侧，抗GRB2信号的量化结果。*，P（P）<.05，n=5，学生t吨检验用于确定统计显著性。

在Sprague-Dawley模型中，大鼠前列腺背外侧叶是前列腺癌易感性增加的主要部位(9,41). 在人类中，前列腺癌主要是一种年龄和激素依赖性疾病。与人类相似，该模型中前列腺病变的发展是激素依赖性的(9,22,23)因为没有激素刺激的Sprague-Dawley大鼠不会患前列腺癌，可能是因为它们的寿命很短（2.5年）。在用于分子分析的动物中，与T+E治疗的溶媒对照组相比，T+E促进的BPA暴露大鼠PIN损伤显著增加(23). 有趣的是，当用RT-qPCR在前列腺外侧部检测这9个基因时，基础表达没有差异（即，在使用促性腺激素治疗[T+E植入]诱导前列腺癌发生之前）(9)观察到；具有增加的H3K4me3的BPA重编程基因以与载体对照相同的水平表达。如所示表3在d70动物中，新生期接触BPA（BPA-O）和载体（V-O）的大鼠成年前列腺中这9个基因的基础表达没有显著差异。然而，激素（T+E）治疗6小时后，只有1/9的基因表达(埃尔布2)与未接受激素（V-O）的车辆处理大鼠相比，新生期接触车辆（V+H）的d70大鼠H3K4me3显著升高。相比之下，7/9的基因(抄送1,埃尔布2,组2,Ikbkb公司,地图2k2,Nfkbia公司，以及Pdgfb公司)与未接受激素治疗（B-O）的经BPA治疗的大鼠相比，新生期接触BPA（BPA+H）的d70大鼠，H3K4me3升高时，其对激素的反应显著增加。补充表6提供了单个动物的原始qPCR数据。这些数据表明，在这些发育重编程基因的TSS中观察到的H3K4me3增加并不是表达增加的结果，而是“启动”了这些基因对激素的过度反应。

BPA通过激活MLL1甲基转移酶活性增加重编程基因的H3K4me3标记

我们的研究结果表明，BPA暴露增加了重编程基因TSS处的H3K4me3，并导致对激素的过度反应；因此，我们接下来试图确定引起这种持久性BPA诱导的表观遗传改变的机制。为此，我们专注于组2，其TSS处的H3K4me3显著增加，并且在被BPA重新编程的前列腺中，响应激素（T+E）的基因表达增加约6倍(图2、A和B，以及表3). Grb2的免疫组织化学分析显示，新生期接触双酚A的T+E颗粒植入动物前列腺侧叶的蛋白质水平表达增加(图2B） ●●●●。

为了确定新生儿BPA暴露增加了H3K4me3，我们使用ChIP-qPCR检测了组2双酚A暴露后新生儿前列腺。TSS处H3K4me3显著增加2倍组224小时。观察BPA暴露后(图3A） 与新生期BPA暴露大鼠成年前列腺中H3K4me3升高相一致。值得注意的是组2在此期间，观察到新生儿前列腺对BPA反应的基因表达(图3B） ，表明观察到的H3K4me3的增加不是BPA诱导的组2转录。这让我们假设H3K4me3增加可能是由于组蛋白甲基转移酶活性的改变，该酶负责“书写”这个表观遗传标记。

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图3。

新生儿BPA暴露激活MLL1。A、 用抗H3K4me3抗体和经溶媒或BPA10治疗的大鼠的新生前列腺样本进行ChIP-qPCR，以测定H3K4me3水平组2.显示了平均值±SEM；*，P（P）<0.05，相对于载体，n=3（合并样本，每个样本包含6个新生儿前列腺）。B、 对注射载体或BPA10的大鼠新生前列腺进行MLL1表达的qPCR分析，以检测Grb2组表达式。显示了平均值±SEM，n=3。C、 使用抗p-AKT（S473）、抗p-S6（S235/236）和注射载体或BPA10（治疗后6 h）的大鼠新生前列腺样本进行PI3K/AKT通路激活的Western blot分析。抗p-AKT和抗p-S6强度的量化分别归一化为抗-AKT和抗S6强度。显示平均值±SEM；*，P（P）<.05，相对于车辆，n=3。D、 对注射载体或BPA10的大鼠新生前列腺进行MLL1激活的Western blot分析。显示平均值±SEM；*，P（P）<.05，相对于车辆，n=3。E、 使用注射有载体或BPA10的大鼠新生前列腺样本，用抗C末端MLL1抗体进行ChIP-qPCR，以检测MLL1的补充情况组2.显示了平均值±SEM；*，P（P）<0.05，相对于载体，n=3（合并样本，每个样本包含6个新生儿前列腺）。学生的t吨该测试用于确定A-E数据的统计显著性。

MLL1是酵母蛋白Set1的哺乳动物同源物，是COMPASS（与Set1相关的蛋白质复合体）的一部分。重要的是，其500-kDa前体被Taspase1裂解，生成成熟的异二聚体MLL1^{编号320/C180}(42)，具有一个位于C末端片段C180中的保守SET结构域，该结构域在K4将组蛋白H3甲基化以生成H3K4me3标记(43,–45). 之前已经证明BPA（和其他EDC）可以激活PI3K/AKT的非基因组ER信号(17)我们假设PI3K/AKT信号可能通过调节MLL1活性来重新编程H3K4me3表观遗传标记。正如预期的那样，对新生儿前列腺裂解物的Western blot分析表明，新生前列腺中的BPA在体内激活了PI3K/AKT信号。如所示图3C、 AKT及其下游效应器S6（PI3K活化标记物）在接触BPA后1小时即被磷酸化，接触6小时后显著增加，这与之前在新生儿前列腺中观察到的BPA激活非基因组ER信号一致(14)和前列腺素(17). 与PI3K/AKT信号的激活一致，MLL1裂解（激活）增加，异二聚体MLL1的两个组分^{编号320/C180}接触BPA 6小时后，与对照组相比，接触BPA的前列腺升高约2倍(图3D） ●●●●。对20个新生儿前列腺样本（10个载体治疗前列腺和10个BPA治疗前列腺）的相关性分析证实，BPA激活PI3K/AKT信号（S6磷酸化）与MLL1 N-和C-末端片段的断裂呈正相关(第页= 0.6569 [P（P）<.01]和第页= 0.8320 [P（P）<.0001]）。这些相关数据得到了MLL1的ChIP-qPCR的支持^180加元入住时间组2BPA暴露24小时后新生儿前列腺。该分析表明，与MLL1的裂解/活化增加一致，甲基转移酶在组2BPA显著增加TSS(图3E） ●●●●。这与在该位点观察到的H3K4me3增加相一致(图3A） ，在没有增加的情况下发生组2基因表达(图3B） ●●●●。这些数据表明，PI3K/AKT信号的激活可以直接增加MLL1的裂解，从而增加其甲基转移酶活性，导致H3K4me3表观遗传标记在靶基因启动子处的重新编程。

我们感谢蒂亚·贝里（Tia Berry）在这项工作中提供的出色技术援助，感谢杰夫·埃弗里特（Jeff Everitt）博士进行的病理分析。

这项工作得到了国家环境健康科学研究所拨款的支持RC2ES018789型；，P30ES023512页;,ES023206和U01 ES026719; 德克萨斯州癌症预防研究所（CPRIT）拨款RP120855型; 和韦尔奇基金会拨款BE-0023号（德克萨斯州休斯顿）（致C.L.W.）。本研究还利用了由CPRIT核心设施支持奖支持的MD Anderson Science Park下一代测序核心RP120348型和贝勒医学院先进技术核心生物信息学核心，由CPRIT核心设施支持奖支持RP120092型以及国家癌症研究所共享资源奖P30CA125123页.

披露摘要：作者无需披露任何信息。