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神经科学杂志。2011年9月28日；31(39): 13746–13757.
数字对象标识：10.1523/JNEUROSCI.1078-11.2011
PMCID公司：项目经理3395796
美国国立卫生研究院：NIHMS328304标准
PMID：21957238

同源密码子相互作用蛋白激酶2通过BMP信号调节肠多巴胺能神经元和胶质细胞的出生后发育

钙铝石,1,* 艾米·A·唐,2,三，* 余磊尚,2,三 Tuan D.Pham公司,1 谢长廷（Ivy Xieh）,2,三 旺达·塞特利克,1 迈克尔·D·格尔森,1和埃里克·J·黄通讯作者2,三
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

营养因子信号对肠神经元在发育过程中的迁移、分化和存活至关重要。然而，调节出生后肠道神经元成熟的机制尚不清楚。在这里，我们证明转录辅因子HIPK2（同源域相互作用蛋白激酶2）是肠神经元成熟和出生后发育期间调节胶质生成所必需的。缺乏HIPK2的小鼠表现出胃肠道（GI）表型谱，包括结肠扩张和胃肠道转运时间减慢。虽然HIPK2的丢失不会影响胎儿发育过程中的肠神经元，但肠神经元在出生后会逐渐丢失嘻哈2−/−优先影响肠道尾部多巴胺能神经元群体的突变小鼠。HIPK2调节出生后肠神经元发育的机制似乎涉及肠神经元对骨形态发生蛋白（BMP）的反应。具体来说，与野生型小鼠肠道神经元比例较大嘻哈2−/−突变体具有异常高水平的磷酸化Smad1/5/8。与BMP信号传导促进胶质生成的能力一致，嘻哈2−/−突变体显示肠神经系统中的胶质细胞显著增加。此外，肠神经元中的自噬体数量增加嘻哈2−/−突变体，突触成熟被阻止。这些结果揭示了HIPK2作为一种重要的转录辅因子在肠神经元和胶质细胞维持中调节BMP信号通路的新作用，并进一步表明HIPK2及其相关信号机制可能在治疗上被改变以促进出生后神经元的成熟。

介绍

肠神经元来源于源自神经嵴的前体细胞，迁移至肠道，并经历漫长的发育和成熟过程(伯恩斯和帕奇尼斯，2009年;Gershon，2010年). 虽然人们对肠神经元发育的早期事件了解很多，但对肠神经元表型多样性、成熟和存活的后作用机制知之甚少(Enomoto等人，1998年;Flynn等人，2007年;Uesaka等人，2007年,2008;Burns和Pachnis，2009年;Uesaka和Enomoto，2010年). 几项研究表明，转化生长因子β（TGFβ）超家族成员骨形态发生蛋白（BMP）调节肠神经元的发育(Chalazonitis等人，2004年,2008;Fu等人，2006年). 有趣的是，骨形态发生蛋白对肠神经元的影响与环境有关；结果取决于BMP信号的时间以及BMP与其拮抗剂Noggin之间的相互作用。例如，BMP可促进神经营养素-3（NT-3）依赖的TrkC+肠多巴胺能神经元的发育。相反，在神经元特异性烯醇化酶（NSE）启动子的控制下表达诺金的转基因小鼠减少了肠道多巴胺能神经元的数量(Chalazonitis等人，2008年). 这些结果支持了BMP信号对肠神经系统（ENS）亚型规范至关重要的观点，并为控制肠多巴胺能神经元的成熟、存活和长期维持提供了重要见解(Li等人，2004年,2006). 此外，增加的BMP信号可促进培养的肠嵴衍生前体细胞和NSE-BMP4转基因小鼠的胶质细胞分化(Chalazonitis等人，2011年).

TGFβ和BMP的信号转导途径涉及Smad蛋白，Smad蛋白是高度进化保守的转录因子，在TGFβ或BMP与其受体结合时被激活(Derynck和Zhang，2003年;马萨格等人，2005年). 在磷酸化后，Smad被转运到细胞核，在那里它们调节TGFβ（Smad2/3）或BMP（Smad1/5/8）靶基因的表达。此外，Smads可以与许多转录辅激活因子或辅抑制因子相互作用，激活或沉默靶基因的转录，从而为TGFβ或BMP信号的最终结果增加了复杂性。HIPK2（同源域相互作用蛋白激酶2）能负性调节细胞系中BMP依赖的报告基因活性，并与Smad1、Smad2、Smad3和c-Ski相互作用(Harada等人，2003年). HIPK2还可以调节感觉、交感和中脑多巴胺（DA）神经元的存活和凋亡(Doxakis等人，2004年;Wiggins等人，2004年;Zhang等人，2007年). 本研究的重点是HIPK2在肠神经元成熟过程中的作用，尤其是多巴胺能亚群。之所以选择这些神经元，是因为它们在调节肠道蠕动方面起着重要作用(Li等人，2004年,2006)可能会感染帕金森氏病(Kuo等人，2010年). 我们的数据表明，肠神经元在出生后需要HIPK2来形成自噬体和突触发生。这些结果强调了HIPK2在调节BMP信号在肠神经元成熟过程中的重要作用，尤其是多巴胺能亚型的成熟过程中。

材料和方法

动物。

这个嘻哈2+/−在混合129上保持突变体；C57BL/6背景。用于生成和基因型的程序嘻哈2−/−先前已经描述过突变体(Wiggins等人，2004年;Zhang等人，2007年). 动物护理由加州大学旧金山分校和哥伦比亚大学动物护理和使用委员会批准，并遵循国家卫生研究院的指导方针。

铜试剂蓝标记和乙酰胆碱酯酶组织化学。

两者都有野生型和嘻哈2−/−用4%多聚甲醛（PFA）灌流10至24周龄的突变小鼠，雌雄各半。分别解剖粘膜下丛和肌间丛。肠壁的层片制剂作为整体进行制备，包括粘膜下层和粘膜下神经丛或附着在纵肌上的肌间神经丛。如前所述，用神经元核糖体标记物铜试剂蓝鉴定神经元(海尼克等人，1987年;Karausmanoglu等人，1996年;Chalazonitis等人，2004年;Chalazonitis等人，2008年). 检查的肠道区域包括胃、十二指肠、空肠、回肠近端和远端以及结肠。

乙酰胆碱酯酶（AChE）活性根据前面描述的程序进行组织化学显示(Enomoto等人，1998年). 简单地说，从近端食道到远端结肠将肠道作为一个整体进行解剖；移除肠系膜附着物和胰腺，并在4°C下用4%PFA将组织后固定1-2小时。然后将组织转移到饱和硫酸钠中，并在4°C下储存过夜。然后在缓冲液（0.2 m）中培养制剂米盐酸乙丙嗪，4 m米乙酰硫胆碱碘化物，10 m米甘氨酸，2米米硫酸铜，65 m米乙酸钠，pH 5.5，2–4小时。乙酰胆碱酯酶染色通过在硫化钠中培养1.5分钟（1.25%，pH 6）进行。在解剖显微镜下拍摄之前，用清水彻底冲洗组织。使用连接到DP70 CCD相机和DP Manager 3.1.1软件的Olympus BX51显微镜拍摄显微照片。为了拍摄照片，沿着肠系膜边界打开肠道，使组织变平，浆膜面朝上，并装入50%的甘油中。Gershon实验室获得的图像由连接到Retiga Ex的徕卡DML6000B显微镜捕获我CCD摄像机使用Improvision Volocity 5.4.1软件。

免疫组织化学。

HIPK2蛋白和HIPK2LacZ公司使用前面描述的程序检测到(Wiggins等人，2004年;Zhang等人，2007年). 为了鉴定ENS中的DA神经元，解剖十二指肠、空肠、回肠和结肠的节段，以暴露层流制备中的肌间或粘膜下神经丛。在用多巴胺抗体标记之前，将组织暴露于改良的固定剂中24小时，以保存组织DA，其中0.1中含有4%的PFA米磷酸盐缓冲盐水、9%蔗糖和0.025%L-抗坏血酸，pH 7.0。在0.1中冲洗5小时后米磷酸盐缓冲液，在4°C下用大鼠DA抗体（1:1000，NT-104，Protos Biotech）再培养24小时。在PBS中冲洗后，将层流制剂与Alexa Fluor 594（1:750，Invitrogen）结合的大鼠IgG驴二级抗体孵育4小时，冲洗并安装Vectashide（Vector Laboratories）。因为DA神经元在肌间神经丛中相对罕见，但在粘膜下神经丛中更为丰富(Li等人，2004年;Chalazonitis等人，2008年)定量分析仅限于粘膜下神经丛的层流制备。对DA和酪氨酸羟化酶（TH）进行双重免疫标记，以验证这两种抗原在同一神经元中的一致位置。

本研究中的主要抗体包括：羊抗甲状腺激素羟化酶多克隆抗体（1:200，P60101，Pel-Freeze）；抗BrdU抗体（1:200，MAB3228，Millipore）；抗NF150抗体（1:400，AB1981，Millipore）；抗裂解caspase 3抗体（1:1000，AF835，研发系统）；抗HuC/D抗体（1:20，A-21271，Invitrogen）；抗LC3抗体（1:50，M152–3，医学和生物实验室）；抗PGP9.5抗体（1:20，ab8189，Abcam）；抗SNAP25抗体（1:20，ab41455，Abcam）；抗HIPK2抗体（1:500，目录号ARP32586-P050，Aviva）；抗GFRα1（1:1000，AB5963，Millipore生物科学研究试剂）；抗PSD95抗体（1:100，目录号2507，细胞信号技术）；抗p75NTR公司抗体（1:2500，G3231，Promega）；抗突触素抗体（1:20，目录号2312，细胞信号技术）；TuJ1抗III类β-微管蛋白抗体（1:1000，MMS-435P，Covance）；抗pSmad1/5/8抗体（1:625，目录号9511，细胞信号技术）；抗pSmad2抗体（1:200，目录号3010，细胞信号技术）；抗TrkC抗体（纽约大学斯基尔贝尔研究所Moses Chao博士赠送）；和抗S100β抗体（1:3000，目录号Z0311，DakoCytomation）。抗HIPK2抗体的特异性通过背根神经节神经元在嘻哈2−/−突变小鼠（数据未显示）。所使用的二级抗体包括与Alexa Fluor 488偶联的驴抗羊IgG（1:500；Invitrogen）、与HRP偶联的抗兔IgG-（Vector Laboratories）和与Alexa-Fluor 594偶联的山羊抗兔抗体（1:625；Invit罗gen）。

肠神经元中的TUNEL。

用TuJ1抗体检测肠道神经元后，在室温下将组织切片在标记缓冲液中培养3分钟，然后添加末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）反应混合物（4μl脱氧核苷酸三磷酸混合物，4μl 50×Mn2+储备溶液、4μl TdT酶和50μl Td T标记缓冲液（R&D Systems）在37°C的加湿室中培养1.5小时。将载玻片与1×停止缓冲液孵育5分钟，终止反应，并将载玻片在PBS中漂洗两次2分钟。为了观察生物素化核苷酸，样品被TdT酶转移到单链DNA的缺口端，在室温下在Strep-Fluor溶液中孵育1小时。然后排空每张载玻片，并用50–75μl防褪色固定介质固定。

电子显微镜。

在出生后第0天（P）、第7天、第16天和第36天，用新制备的4%甲醛（来自多聚甲醛）和0.2%戊二醛的混合物在0.1米磷酸盐缓冲液，pH 7.4。解剖胃、十二指肠、回肠和结肠的部分，并将其放置在4%甲醛（来自多聚甲醛）和2.5%戊二醛的同一缓冲液中，在4°C下过夜。肠段在室温下用2%四氧化锇处理1h，在PBS和马来酸缓冲液中冲洗5次，并染色整体用5%醋酸铀酰水溶液在冰上放置1小时。用一系列分级乙醇溶液将组织块脱水，用环氧丙烷清除，并嵌入聚合EMbed-812（Ted Pella）中。用切片机（Reichert-Jung，Reichert）切割超薄切片（1微米）并收集在铜网格上。切片用JEOL 1200EX电子显微镜检查。

肠道运动测量。

使用修改自Carai等人（2006年）.六野生型和五个嘻哈2−/−本研究使用了8至12周龄的雌雄小鼠。在研究过程中，小鼠被单独饲养，在测量胃肠总转运时间之前，没有被剥夺食物。将二甲苯氰醇FF和溴酚蓝（各0.25%w/v）悬浮在含有0.5%甲基纤维素的水中，并用喂食针（25 gauge，1英寸长，1.25 mm球径）灌胃给药，剂量为每只小鼠0.3 ml。从给药二甲苯氰醇FF和溴酚蓝后立即开始，在预先称重的试管中收集粪便颗粒，每30分钟测定一次湿重，持续6小时。为了测定总胃肠转运时间（GITT），每隔30分钟对小鼠进行一次监测。蓝色药丸消失和第一个出现棕色药丸所需的时间记录为GITT。将粪便颗粒真空干燥过夜以确定干重。粪便颗粒中的水分含量被测定为粪便湿重和干重之间的差异。

量化和统计分析。

使用40倍物镜在覆盖1.254 mm的10个相邻的非重叠矩形区域内对神经元和胶质细胞体进行计数2指神经丛，作为一个测量单位。计数神经元的研究人员对动物的基因型是盲目的。使用铜试剂蓝作为神经元标记物，从肠道的每个区域和每个神经丛中获得的测量值如下所示表1自噬的发生率估计为已识别的自噬体图谱的百分比，标准化为10−3μm2神经丛单位面积。来自的节嘻哈2−/−和野生型对小鼠进行了类似的检查和比较。肌间神经丛中的突触数量是通过列举包含清晰描绘的突触前按钮、突触小泡、突触裂和突触后密度的结构来确定的。根据标准化为10的突触数量计算突触密度−3毫米2单位面积。计算平均值±SEM，并通过Student’st吨检验（两个值的平均值之间）或方差分析（ANOVA；Tukey或Bonferroni-Dunn事后（post-hoc）比较），值的平均值大于2。

表1。

肌间神经丛和粘膜下神经丛神经元胞体的测量数量野生型和嘻哈2−/−突变小鼠

肠道区域野生型
嘻哈2−/−突变体
老鼠†(N个)测量(n个)*老鼠†(N个)测量(n个)*
肌间神经丛
    胃218218
    十二指肠859859
    空肠757745
    近端回肠529530
    远端回肠三18三18
    远端结肠424424
粘膜下丛
    十二指肠859854
    空肠752745
    近端回肠528524
    远端回肠三14三18
    远端结肠421424

*每次测量都对应于用40倍物镜扫描10个显微镜场所得的值。

†标本采集自野生型和嘻哈2−/−10周龄、12周龄、16周龄、21周龄和24周龄的突变小鼠，雌雄各半。

结果

围生儿死亡率和肠动力异常嘻哈2−/−突变体

纯合子臀部2(嘻哈2−/−)突变体出生时孟德尔比率正常，未表现出明显异常；然而，约40%嘻哈2−/−突变株在断奶前死亡，大多数在出生后2–3天内死亡(图1A类). 相反，杂合子嘻哈2(嘻哈2+/−)小鼠存活到成年野生型是室友干的。其中之一嘻哈2−/−在出生后3天内死亡的突变体，几乎都缺乏胃里的牛奶(图1B类，顶部）。尸检时，小肠膨胀，含有大量空气(图1B类，底部）。剩下的60%嘻哈2−/−突变体存活到成年，但体重增长缓慢，并且保持异常小(图1C类). 到12周大时嘻哈2−/−突变体仅为野生型（24.2克英寸野生型与17.2克英寸相比嘻哈2−/−突变体）(图1C类). 相比之下嘻哈2−/−通过鼻子到肛门的距离测量，突变体与野生型小鼠（数据未显示）。重要的是，没有证据表明胃肠道表型是由先天畸形引起的，例如气管食管瘘。

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围产期死亡率和胃肠道表型嘻哈2−/−突变小鼠。A类–B类.超过40%嘻哈2−/−混合组中的突变小鼠129只；B6背景在出生后死亡，大多数在出生后2天内死亡(A类). 大多数垂死的人嘻哈2−/−突变体没有胃里有牛奶的迹象（箭头突出显示）(B类，顶部）。相比之下野生型室友吐奶(B类，顶部，箭头）。尸检嘻哈2−/−P0处的突变小鼠显示肠道轻度扩张，充满气体(B类，底部，箭头）。C类，与正常体重增长相比野生型小鼠出生后12周内，嘻哈2−/−两种性别的突变小鼠均表现出体重增加减少，但不影响身体长度（数据未显示）。D类–G公司，成人嘻哈2−/−突变小鼠（8-12周龄）胃肠转运时间延长(D类)，减少排便量(E类,F类)减少粪便中的水分(G公司). 学生的t吨测试，n个=6，用于野生型和嘻哈2−/−突变体*第页< 0.05.

膨胀的肠道嘻哈2−/−围产期突变和产后体重增加不良表明胃肠动力可能异常。为了验证这一假设，在野生型和嘻哈2−/−突变体。结果表明，GITT在嘻哈2−/−变种比in野生型小鼠（15.3±1.3小时vs 11.3±0.9小时，n个= 6,第页< 0.05) (图1D类). 此外，在正常喂养条件下臀部2−/−突变体比野生型老鼠，不考虑粪便水(图1E类,F类). 大便的含水量嘻哈2−/−此外，突变体仅为野生型老鼠(图1G公司).总之，这些结果表明胃肠动力在臀部2−/−突变体，导致新生儿肠道膨胀和成年小鼠便秘。

Loss of neurons in myenteric and submucosal plexuses in嘻哈2−/−突变体

目的探讨胃肠道转运异常的机制嘻哈2−/−突变体，我们表征了HIPK2在ENS中的表达嘻哈2LacZ公司作为一名记者，我们早在胚胎期（E）15.5天就检测到小肠和大肠壁神经元中分散的HIPK2表达（数据未显示）。HIPK2LacZ公司通过P0在肠神经元中持续表达(图2A–C,G–I). 与这些结果一致，在肠神经元细胞核内的斑点中使用HIPK2特异性抗体检测内源性HIPK2蛋白(图2D–F型). 在成年小鼠中，HIPK2LacZ公司在小肠和大肠的肌间神经丛中显示出与神经元簇的广泛共定位(图2J–N公司).

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出生后肠道神经元中HIPK2的表达。A类–C类，可以使用HIPK2检测HIPK2的表达LacZ公司十二指肠肌间神经丛(A类)、小肠(B类)、和冒号(C类). 比例尺：（inC类)A类–C类，50微米。D类–我，共聚焦图像表明内源性HIPK2蛋白(D类–F类)，使用抗HIPK2抗体和HIPK2检测LacZ公司(G公司–我)用抗β-半乳糖苷酶抗体检测，显示与神经元标记物TuJ1广泛共定位。注意HIPK2蛋白(D类–F类（绿色通道）在肠神经元的细胞核（TuJ1+，红色通道）中以点状存在。浆膜层纤维组织中检测到绿色通道中的背景染色(G公司,我). 比例尺：（in我)D类–我，20微米。J–N个，HIPK2在成年小鼠肠道神经元中的表达也可以通过HIPK2的整体染色来检测LacZ公司在回肠和近端结肠的肌间神经丛中。注意HIPK2的不同聚集体LacZ公司在肌间神经丛中（箭头突出显示），周围弥漫着浅绿色的HIPK2LacZ公司活性进入邻近组织(J,K（K）). 共焦显微镜显示HIPK2的广泛共定位LacZ公司图J1位于P32(L（左）–N个). 比例尺：（英寸K（K）)J,K（K），200微米；（英寸N个)左旋-右旋，20微米。

采用了几种方法来确定HIPK2的丢失是否影响肠神经元的数量。首先，我们描述了胎儿期肠道神经元的发育特征。我们使用p75NTR公司作为嵴衍生细胞、BrdU和各种神经元标记物的标记物，包括β3-微管蛋白、神经丝（NF150）、PGP9.5和HuC/D，用于量化发育中肠道中的前体细胞和神经元。发育中ENS的峰衍生细胞和神经元数量野生型小鼠与嘻哈2−/−E15.5或E18.5处的突变体（数据未显示）。其次，我们使用整个坐骑中的乙酰胆碱酯酶活性来可视化出生后肠道中的ENS。由于80%以上的肠道神经元是胆碱能神经元(Sang and Young，1998年;Furness，2006年)而绝大多数肠神经元和轴突表达AChE，AChE全染色为评估ENS内神经元细胞体和神经纤维的整体组织提供了一种方便的工具(Blaugrund等人，1996年;Wang等人，2010年). 在野生型P0肠、神经节发育良好(图3A–C和神经连接物被乙酰胆碱酯酶反应产物强烈染色(图3A–C，箭头）。相比之下嘻哈2−/−突变型ENS小于野生型老鼠(图3D–F型，箭头），神经连接物的密度以及AChE染色的强度降低(图3D–F型，箭头）。在成人肠道中也检测到类似的乙酰胆碱酯酶活性模式；同样，肠神经节的大小和神经连接物的密度在嘻哈2−/−突变体(图3J–L型)，与相比野生型控件(图3G–I).

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十二指肠、回肠和结肠肌间神经丛的神经节大小和节间神经纤维减少臀部2−/−出生后阶段的突变体。A类–F类，十二指肠、回肠和近端结肠的整体AChE染色显示肌间神经丛（箭头）缩小，神经纤维染色强度降低嘻哈2−/−突变体（箭头）早在P0。比例尺：（inF类)A类–F类，200微米。G公司–L（左）肌间神经丛和神经纤维的缩小在嘻哈2−/−P35处的突变比P0处的突变，尤其是结肠。比例尺：（inL（左）)G公司–L（左），200微米。

肠道中乙酰胆碱酯酶活性降低嘻哈2−/−突变体提示肠神经元的数量可能减少。为了验证这一点，我们使用铜试剂蓝作为神经元标记物来分析肠神经元的堆积密度。肌间神经丛和粘膜下神经丛中的神经元数量嘻哈2−/−12周龄的突变株明显低于野生型老鼠(图4A–D). 有趣的是，对小肠和大肠肌间神经丛中神经元堆积密度（单位面积神经元数量）的量化野生型和臀部2−/−突变体在P1没有差异。然而，肌间神经丛中的神经元逐渐减少嘻哈2−/−P14和P85突变(图4E类,F类). 通过P85嘻哈2−/−与野生型小鼠，取决于分析的肠道区域(图4F类). 此外，P85粘膜下神经元的堆积密度嘻哈2−/−突变体也同样低于野生型老鼠(图4G公司).

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肠神经元，包括多巴胺能神经元的丢失嘻哈2−/−出生后生活中的突变小鼠。A–D，肌间神经丛和粘膜下神经丛的全套铜蛋白蓝染色显示成人的神经元密度降低嘻哈2−/−突变小鼠。比例尺：（英寸D类)A类–D类，100微米。E类,F类，肌间神经丛神经元的年龄依赖性减少嘻哈2−/−突变体。在P1，肌间神经丛的单位面积没有可检测到的神经元丢失嘻哈2−/−突变体。然而，从P14到P85（或12周龄）的肌间神经丛中存在神经元的渐进性丢失嘻哈2−/−突变体。肌间神经丛神经元的年龄依赖性减少嘻哈2−/−突变体表现为单位面积的神经元密度(E类)或以百分比表示野生型神经元(F类).G公司，与肌间神经丛相似，12周龄的粘膜下神经丛也检测到神经元密度降低（P84）嘻哈2−/−突变体。H（H）–M（M），通过在胃粘膜下神经丛中制备多巴胺（红色）和酪氨酸羟化酶（绿色）双重免疫荧光的全套制剂，鉴定ENS中的多巴胺能神经元野生型(H（H）–J)和嘻哈2−/−突变小鼠(K（K）–M（M）). 注意，多巴胺能神经元在嘻哈2−/−突变体与野生型同窝的人。比例尺：（inM（M）)H（H）–M（M），50微米。N个对十二指肠、空肠、回肠和结肠中多巴胺能神经元密度的量化显示，所有区域的多巴胺能神经密度持续降低。O（运行）,P（P），即使多巴胺能神经元密度标准化为粘膜下神经丛中神经元总数的比例(O（运行）)或作为的百分比野生型室友(P（P）)，空肠、回肠和结肠仍显著减少。在P84时，每个基因型至少有三只动物被计数，肠道每个区域的测量总数如下所示：十二指肠(野生型,n个= 36;嘻哈2−/−,n个= 42); 空肠(野生型,n个= 36;嘻哈2−/−,n个= 23); 回肠(n个=每个基因型30）；和冒号(n个=每个基因型13个）。学生的t吨测试*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页<0.005和ns（不显著）。

HIPK2缺失导致ENS多巴胺能神经元严重减少

ENS含有多巴胺能神经元，对肠道运动有重要调节作用(Li等人，2004年,2006); 此外，ENS多巴胺能神经元的发育受TGFβ超家族成员（如BMP-2、BMP-4）及其拮抗剂（如Noggin）的调控(Chalazonitis等人，2008年). 由于我们之前的结果表明嘻哈2−/−突变体在中脑腹侧丢失了大量多巴胺能神经元(Zhang等人，2007年)，我们假设HIPK2的丢失也可能对ENS中多巴胺能神经元的发育产生负面影响。为了验证这一假设，我们使用多巴胺抗体和TH作为标记物对ENS的多巴胺能神经细胞进行定量。十二指肠、空肠、回肠和结肠从野生型和嘻哈2−/−12至24周龄的男女同窝婴儿(n个=5，用于野生型和n个=6，用于嘻哈2−/−突变体）。多巴胺能神经元的堆积密度，通过单独观察多巴胺免疫反应性或同时观察多巴胺和TH免疫反应性来确定，以每毫米为单位进行定量2粘膜下丛。与以往研究一致(Li等人，2004年)，我们发现多巴胺能神经元在野生型小鼠，在同一神经元的细胞质中检测到多巴胺和TH免疫反应(图4H–J型). 在嘻哈2−/−然而，突变株在十二指肠、空肠、回肠和结肠粘膜下丛中DA神经元的绝对数量持续减少(图4K–M公司). 为了确定多巴胺能神经元堆积密度的降低是否反映了在检查的肠道四个区域观察到的整体神经元堆积密度降低，我们将多巴胺能神经细胞的数量标准化为野生型和嘻哈2−/−突变体。而十二指肠多巴胺能神经元的正常化百分比在嘻哈2−/−突变体，减少到72%野生型空肠水平，达到53%野生型回肠水平，达到野生型结肠中的水平(图4O（运行）,P（P）). 这些数据表明，除了十二指肠外，肠道多巴胺能神经元的减少在臀部2−/−突变体与总神经元数量相关，因此不能简单地反映在肠道所有区域观察到的神经元总数的减少。多巴胺能神经元的减少似乎在肠道的尾部区域更为严重(图4O（运行）,P（P）).

肠末端TrkC表达神经元减少嘻哈2−/−突变体

我们以前曾报道过多巴胺能神经元构成肠道TrkC表达（TrkC+）神经元的一个子集(Chalazonitis等人，2008年)BMP-2和BMP-4促进肠嵴衍生前体细胞培养物中TrkC+神经元的发育(Chalazonitis等人，2004年). 与这个概念一致，NT-3和BMP-4促进TH表达神经元的分化；此外，过度表达BMP-4的转基因小鼠（NSE-BMP-4小鼠）的多巴胺能神经元数量增加(Chalazonitis等人，2004年,2008). 相反，过度表达BMP拮抗剂Noggin的转基因小鼠（NSE-Nog小鼠）的ENS中TrkC+神经元和DA神经元的数量减少(Chalazonitis等人，2004年,2008). 因为在嘻哈2−/−突变体(图4) (Zhang等人，2007年)，我们推断TrkC+神经元的分化和维持也可能受到嘻哈2−/−突变型ENS。为了验证这一假设，我们使用12周大的十二指肠、空肠和回肠的全套制剂定量测定了肌间神经丛和粘膜下神经丛中的TrkC+神经元野生型和臀部2−/−突变小鼠(图5). 我们的结果表明每毫米TrkC+神经元的堆积密度2神经丛的嘻哈2−/−突变体明显少于野生型小鼠空肠肌间神经丛[59±4(n个=21）与74±3英寸相比野生型(n个= 22),第页<0.005]和回肠[44±3(n个=12）与78±5英寸野生型(n个= 18),第页< 0.0001]. TrkC+神经元堆积密度的降低也见于嘻哈2−/−回肠中的小鼠[21±1(n个=21）与37±2英寸野生型(n个= 26),第页<0.0001]但在十二指肠-空肠中不存在[44±2(n个=36）相比野生型46 ± 2 (n个= 29)] (图5A类,B类). 与TrkC+神经元堆积密度降低一致野生型)十二指肠-空肠肌间神经丛减少，回肠甚至更多，而粘膜下神经丛减少仅在回肠显著(图5C类). 这些结果与肠多巴胺能神经元减少程度的近似梯度相一致(图4)支持HIPK2与多巴胺能神经元的基本作用类似，是维持ENS中TrkC+神经元所必需的。

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嘻哈2−/−突变小鼠显示回肠肌间神经丛和粘膜下神经丛中TrkC+神经元减少。A类,B类，整体免疫组化显示十二指肠-空肠和回肠肌间神经丛TrkC+神经元减少(A类). TrkC+神经元的减少也见于嘻哈2−/−突变体(B类)但不在十二指肠-空肠。C类、TrkC+神经元密度嘻哈2−/−突变体肌间神经丛，表示为野生型窝友控制，回肠减少更显著(n个=15）比十二指肠-空肠(n个= 21,第页< 0.0001). 相反，粘膜下丛TrkC+神经元的减少仅在回肠中显著(n个= 21). 星号（*）表示与野生型; 学生的t吨测试，第页< 0.0001.

HIPK2缺失增加肠神经元的BMP信号

我们以前已经证明BMP-2和BMP-4调节肠神经元的发育，包括多巴胺能亚群、肠神经节生成和肠神经胶质细胞的发育(Chalazonitis等人，2004年,2008;Faure等人，2007年). 由于BMP-2和BMP-4是TGFβ超家族的成员，HIPK2已被证明与受体调节的Smads（包括Smad1、Smad2和Smad3）发生物理相互作用，并调节Smad-dependent基因的表达(Harada等人，2003年;Zhang等人，2007年)，我们推测HIPK2的缺失可能会影响BMP信号传导。为了验证这一假设，我们通过检测小肠肌间神经丛和粘膜下神经丛肠神经元磷酸化Smad1/5/8（pSmad1/8/8）的表达来表征肠神经元中BMP信号的特征野生型和嘻哈2−/−突变体。而pSmad1/5/8染色在肠神经元中没有发现差异野生型和嘻哈2−/−P0突变，12周龄回肠和结肠肌间神经丛中核pSmad1/5/8阳性神经元较多嘻哈2−/−突变体野生型室友(图6A类与B类和E类与F类和数据未显示）。当归一化为肠道相应区域的神经元总数时，回肠肌间神经丛中神经元的百分比要高得多嘻哈2−/−小鼠（20.8±1.3%）pSmad1/5/8染色阳性野生型小鼠（5.97±0.5%）(图6G公司，左）。pSmad1/5/8染色在粘膜下丛神经元中也更明显嘻哈2−/−小鼠（32.8±2.7%）野生型动物（16.7±1.3%）(图6C类与D类和G公司，对，第页< 0.005). 在结肠肌间神经丛中也检测到pSmad1/5/8阳性神经元的类似增加嘻哈2−/−与野生型(16.2 ± 1.4%) (图6G公司). 与pSmad1/5/8免疫反应阳性神经元的较高百分比相比，我们发现在嘻哈2−/−突变体（数据未显示）。回肠和结肠中pSmad1/5/8免疫反应与更严重的神经元丢失和更高百分比的神经元的反向关系臀部2−/−突变体表明肠神经元中BMP信号的异常增加可能与观察到的表型有关。

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HIPK2缺失导致肌间神经丛和粘膜下神经丛肠神经元中pSmad1/5/8的表达增加。A类–F类，整体免疫染色显示肌间神经丛中pSmad1/5/8阳性神经元显著增加(A类,B类)和粘膜下丛(C类,D类)在12周龄的回肠和结肠中（P84）嘻哈2−/−突变小鼠与野生型请注意，pSmad1/5/8免疫染色的强度在肠道神经元之间有所不同。为了保持一致，对强烈和中度阳性的肠道神经元进行计数比例尺：（inD类)A类–D类，50微米。E类,F类组织学切片显示细胞核pSmad1/5/8（绿色荧光）和神经元标记物TuJ1（红色荧光）在肌间神经丛中的共定位野生型和嘻哈2−/−突变体。比例尺：（inF类)E类,F类，10微米。G公司，在野生型肌间神经丛，5.97±0.54%(n个=30）和16.2±1.4%(n个=5）的总神经元分别在回肠和结肠中显示pSmad1/5/8的阳性染色。相反，回肠和结肠的pSmad1/5/8阳性神经元分别为20.8±1.4%和47.2±4.7%嘻哈2−/−突变体。在回肠粘膜下丛中也检测到pSmad1/5/8的类似增加嘻哈2−/−突变体，32.8±2.7%(n个=26）相比16.7±1.3%(n个=35）英寸野生型.学生的t吨测试，n个=每个基因型5个，以及第页< 0.005. 请注意，pSmad1/5/8免疫染色神经元的增加比例明显更高(第页<0.005）在结肠中比在回肠中嘻哈2−/−老鼠。

神经胶质细胞密度增加嘻哈2−/−突变小鼠

除了在肠神经元发育中的作用外，BMP-2和BMP-4还可以调节ENS中的胶质生成。过度表达BMP-4（NSE-BMP-4）的小鼠显示胶质细胞密度和胶质细胞与神经元的比率增加(Chalazonitis等人，2011年). 由于HIPK2的丢失导致BMP信号的显著增加，我们推断ENS中的胶质细胞发育臀部2−/−突变体可能会感到不安。为了测试这一点，我们首先确定HIPK2是否在肠神经胶质中表达。使用检测β-半乳糖苷酶的抗体（针对HIPK2LacZ公司)和S100β（对于胶质细胞），我们发现在P0时极少数胶质细胞中存在HIPK2，但从P16到P32表现出逐渐增加(图7A–C). 值得注意的是，成人肌间神经丛中的胶质细胞密度（P32）嘻哈2−/−小鼠（单位：mm2在十二指肠中显著增加[198±10.4(n个=15）英寸臀部2−/−与167±7.8相比的突变(n个=12）英寸野生型,第页<0.05]和回肠[284.3±16.5(n个=12）英寸嘻哈2−/−与181.3±11.6相比的突变(n个=12）英寸野生型] (图7D类,E类,H（H）). 在回肠粘膜下丛中也检测到类似的胶质细胞密度增加嘻哈2−/−小鼠[103±7(n个=12）与78.2±3.4相比(n个=12）英寸野生型]但不在十二指肠(图7F类,G公司,我). 当标准化为百分比时野生型同窝卵的胶质细胞密度嘻哈2−/−突变体在十二指肠肌间神经丛（118.4±6%）和回肠（156.8±9%）以及回肠粘膜下神经丛（131.4±8%）中持续显著增加(图7J). 因此，与神经元密度的减少类似，神经干细胞中胶质细胞密度的增加嘻哈2−/−突变体也表现出近远端梯度。

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嘻哈2−/−突变小鼠的肌间神经丛和粘膜下神经丛中的胶质细胞密度增加。A类–C类，共焦图像显示HIPK2的表达LacZ公司胶质细胞（抗β-半乳糖苷酶抗体检测）（抗S100β抗体检测）。在P0时，肠胶质细胞中HIPK2的表达非常有限(A类). 然而，HIPK2的表达LacZ公司显示P16的胶质细胞逐渐增多(B类)和第32页(C类)（箭头）。比例尺：（inC类)A类–C类，20微米。D类–G公司S100β的整体免疫染色显示，12周龄婴儿的肌间神经丛和粘膜下神经丛中的肠神经胶质细胞增多嘻哈2−/−与他们相比的突变体野生型室友(n个＝3）。这些图像是使用40倍物镜在微分干涉对比显微镜下拍摄的，这样可以更好地描绘胶质和神经元细胞体。请注意，胶质细胞体及其小细胞核（箭头所示）的棕色免疫反应描绘出神经节，胶质突起包裹着主要由较大神经元细胞体和细胞核构成的浅色腔隙。比例尺：（英寸E类,G公司)D类–G公司，50微米。H（H），胶质密度（每毫米2肌间神经丛增加嘻哈2−/−十二指肠、空肠和回肠中的突变小鼠，但回肠中的突变小鼠明显更高。我，粘膜下丛胶质细胞密度嘻哈2−/−突变体仅在回肠中显著增加。J，胶质细胞密度标准化为野生型证实了以毫米表示的数据2神经丛。

自噬增加，而非凋亡，发生在嘻哈2−/−突变体

我们以前的研究结果表明，腹侧中脑DA神经元的缺失嘻哈2−/−突变体是由于程序性细胞死亡期间细胞凋亡增加所致(Zhang等人，2007年). 正如腹侧中脑DA神经元一样，肠神经元的发育也是一个从胎儿期到出生后的漫长过程(Pham等人，1991年;Liu等人，2009年). 然而，尚不清楚肠神经元，包括那些具有多巴胺能表型的神经元，在发育过程中是否表现出程序性细胞死亡(Gianino等人，2003年). 确定肠神经细胞是否在嘻哈2−/−突变体是由于神经元死亡的增加，我们使用TUNEL分析结合β3-微管蛋白免疫反应性的证明来量化经历凋亡的神经元的数量。因为肠神经元的丢失嘻哈2−/−突变体直到出生后第二周才变得显著，我们重点分析了P7和P14小鼠的肠道神经元。与中脑腹侧多巴胺能神经元相反嘻哈2−/−突变体在两个年龄段都与WT小鼠无显著差异（数据未显示）。这些观察表明嘻哈2−/−突变不是由于细胞凋亡增加。

为了确定HIPK2的丢失是否影响了出生后肠道神经元的成熟，我们使用电子显微镜（EM）检测了肠神经细胞的ENS臀部2−/−突变体。在P16，神经元轴突和胞体中的溶酶体和自噬体显著增加嘻哈2−/−突变体(图8B类,D类). 回肠末端也有许多肿胀的轴突，其中含有异常的线粒体和细胞质空泡。相反，轴突野生型肌间神经丛组织紧密，轴突或细胞质中只发现极少数小的自噬体(图8A类,C类). 有趣的是，与肠道远端较严重的神经元表型一样，回肠和结肠中自噬体神经元的数量也在逐渐增加(图8E类). 与自噬体的增加一致，在结肠肌间神经元的P7和P17处，微管相关蛋白-1轻链3（LC3）免疫荧光的强度显著增加，这是自噬活性的指标嘻哈2−/−突变体(图8F类,G公司).

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肠神经元自噬增加嘻哈2−/−突变体。A类–D类电子显微镜分析显示轴突和细胞质中的自噬体数量增加嘻哈2−/−P16突变(B类,D类，箭头）。相反野生型小鼠出现紧密的束，没有自噬体的证据(A类,C类). 比例尺：（英寸B类,D类)A类–D类500微米。E类，自噬体数量的量化（每10个−3μm2表面积）(n个=31英寸野生型和n个=15英寸嘻哈2−/−突变体），十二指肠(n个=21英寸野生型和n个=16英寸臀部2−/−突变体），回肠(n个=31英寸野生型和n个=20英寸嘻哈2−/−突变体）和结肠(n个=20英寸野生型和n个=24英寸嘻哈2−/−突变株）。虽然在胃和十二指肠中检测到自噬体没有显著差异，但在肠和结肠中有显著增加臀部2−/−突变体。F类,G公司与EM结果一致嘻哈2−/−P7处的突变体显示LC3免疫荧光信号弥漫增加（箭头）。比例尺：（inG公司)F类,G公司，20微米。

肌间神经丛神经节内突触减少嘻哈2−/−老鼠

众所周知，脊髓间神经元形成神经节内突触和复杂的微循环，使ENS能够表现出整合的神经元活动并独立控制肠道的行为。中的表型嘻哈2−/−突变体，包括异常GITT、神经连接物密度降低和神经元数量减少，表明HIPK2的丢失也可能影响肌间神经丛中突触的形成。为了验证这一假设，我们描述了肠内神经节内突触的发育特征嘻哈2−/−老鼠。而SNAP-25、synaptotagmin和PSD-95等突触标记物的表达在神经元中表现出类似的强健染色野生型粘膜下丛和肌间丛，这些标记物在成人肠道中显著减少嘻哈2−/−突变体(图9A–C与D–F型). 进一步分析突触标记表达减少的原因嘻哈2−/−突变体，我们使用EM检测出生后不同阶段的突触生长。早在P0，肠神经元上就发现了离散的突触结构野生型和嘻哈2−/−老鼠；在十二指肠、回肠和近端结肠中观察到这些结构，包括突触小泡、突触裂和突触后密度(图9G–J型). 有趣的是，从出生后的P0到P36，肌间神经丛中的突触密度逐渐增加，表明肠神经元在出生后的相当长一段时间内继续成熟(图9K（K）和数据未显示）。与P0相比，P36的突触数量野生型十二指肠、回肠和结肠分别增加了2倍、2.3倍和2.5倍(图9K（K）). 相反臀部2−/−小鼠实际上没有从P0增加到P36(图9K（K）). 重要的是，尽管突触的密度嘻哈2−/−十二指肠和回肠突变体没有显著减少，近端结肠突触密度在P0(第页= 0.0068,n个= 4,图9K（K）). 在肌间神经丛中发现的少数突触嘻哈2−/−P36小鼠的组织结构较差，缺乏离散的突触结构，如突触裂和突触后密度(图9H（H）,J).总之，对出生后肠道神经元的EM分析支持HIPK2缺失导致自噬体显著增加以及突触发生和成熟停滞的观点。

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脊髓间神经丛的神经节内突触减少嘻哈2−/−突变体。A–F突触蛋白SNAP-25的免疫荧光图像显示P36结肠肌间神经丛（MP）和粘膜下神经丛（SMP）的信号强度降低嘻哈2−/−突变体。箭头表示肌间神经丛中的神经元，箭头表示粘膜下神经丛的神经元。比例尺：（inF类)A类–F类，40微米。G公司–J，成人回肠肌间丛和近端结肠突触的代表性EM图像野生型(G公司和我）和嘻哈2−/−突变体(H（H）和J）。而突触在肠神经元中发育良好野生型老鼠(G公司,我)，肠神经元嘻哈2−/−突变体显示回肠和近端结肠的突触数量减少(H（H）,J). 比例尺：（inJ)G公司–J，1微米。K（K），单位面积突触数量的量化（×10−3μm三)在十二指肠（D）、回肠（I）和近端结肠（PC）中，P0和P36显示出生后ENS的突触密度显著增加野生型老鼠。相反，嘻哈2−/−突变体小鼠在P0时突触密度适度降低，而从P0到P36的突触密度没有进一步增加。

讨论

我们的结果强调了HIPK2在肠神经元和胶质细胞出生后发育中的重要作用。HIPK2的缺失对肠神经元或其祖细胞的产前发育没有影响，但会导致肠神经元的逐渐丢失，并在出生后的生活中阻止突触成熟。虽然在P0时肠道神经元没有明显减少，嘻哈2−/−突变株在围产期表现出胃和小肠扩张(图1). 这些表型并不是由先天性畸形引起的，例如气管食管瘘，这可能会干扰进食。相反，有两个因素可能会导致臀部2−/−突变体在P0。首先，结肠近端的突触密度显著降低嘻哈2−/−P0处的突变体(图9). 此外，在十二指肠和回肠中也检测到突触密度的适度降低嘻哈2−/−P0处的突变体(图9). 这些突触缺陷可能导致围产期肠道运动功能受损，并可能持续到成年。其次，中脑腹侧DA神经元的缺陷可能与嘻哈2−/−围产期的突变体可能会干扰它们的进食能力(Zhang等人，2007年).

神经内分泌系统多巴胺能神经元的显著缺失嘻哈2−/−出生后阶段的突变使人想起黑质致密部（SNpc）和腹侧被盖区（VTA）的多巴胺能神经元表型(Zhang等人，2007年). 然而，在臀部2−/−ENS和腹侧中脑（vMB）多巴胺能突变体表型。例如，SNpc和VTA中多巴胺能神经元缺陷的发病嘻哈2−/−突变体与程序性细胞死亡期间凋亡神经元的显著增加相一致。腹侧中脑多巴胺能神经元嘻哈2−/−突变体在TGFβ的存在下也无法存活，这表明HIPK2需要在这些神经元中传递TGFβ发出的生存信号。与这一概念一致体外和体内研究支持TGFβ亚型是中脑多巴胺能神经元的前存活营养因子的观点(Poulsen等人，1994年;Krieglstein等人，2000年;Zhang等人，2007年). 相反，在ENS中没有发现凋亡增加嘻哈2−/−突变体和肠神经元丢失的时间进程嘻哈2−/−突变体出生后间隔时间较长。而神经元缺陷的潜在机制嘻哈2−/−突变体尚不清楚，值得注意的是，与交感和感觉神经元不同，肠道神经元缺乏营养因子支持似乎不会引发传统的细胞凋亡。在之前的研究中(Gianino等人，2003年)在小鼠胚胎期、出生后早期或成年期，肠神经元caspase-3免疫反应均未见增加。有趣的是，ENS中GDNF受体GFRα1的缺失导致非常规细胞死亡，这与常见细胞死亡执行者（如caspase-3或caspase-7）的激活无关。此外，由GDNF剥夺引起的神经死亡不能被caspase抑制剂或Bax缺乏阻断(Uesaka等人，2007年). 唯一一个与ENS相关的凋亡细胞死亡案例发生在早期迷走神经嵴衍生细胞中，这些细胞是向肠道迁移的祖细胞。在发育中的鸡胚中使用显性阴性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9阻断迁移性迷走神经嵴衍生细胞的细胞死亡，可增加近端前肠的肠神经元数量（高神经节病）(Wallace等人，2009年). 总之，这些结果表明，ENS细胞凋亡的表现可能依赖于阶段，有丝分裂后神经元营养因子支持的丧失可能导致这些神经元通过非常规的退化过程被移除(Enomoto，2009年).

虽然TGFβ亚型支持vMB多巴胺能神经元的存活，但其在肠神经元存活和成熟中的作用尚不清楚。在肠神经嵴衍生细胞的培养中，我们发现低剂量BMP-2或BMP-4促进肠神经细胞的发育，而高剂量和长时间暴露抑制肠神经细胞发育。这些结果表明BMPs对肠神经元发育的影响可能与环境相关(Chalazonitis等人，2004年). 与这一想法一致，过度表达BMP拮抗剂Noggin的转基因小鼠显示，早期退出细胞周期的神经元数量增加，但后期退出细胞循环的神经元数量减少，如多巴胺能神经元(Chalazonitis等人，2004年,2008). 值得注意的是，在剩余的肠道神经元中发现了高于正常水平的pSmad1/5/8嘻哈2−/−突变体(图6); 然而，pSmad2水平没有明显变化（A.A.Tang和Y.Shang，未发表的观察结果）。虽然HIPK2的缺失如何导致pSmad1/5/8的上调尚不清楚，但我们确实知道HIPK2是一种转录辅抑制因子，可以直接与Smad1相互作用并抑制BMP依赖的报告基因表达(Harada等人，2003年). 与中的结果一致图6，pSmad1/5/8在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中上调嘻哈2−/−BMP治疗后的突变。相比之下，TGFβ治疗后，嘻哈2−/−MEF显示pSmad2显著低于野生型MEF（Y.Shang，未发表的观察结果）。因此，可能需要HIPK2来通过抑制Smad1/5/8的激活来防止过度BMP信号。因此，HIPK2的缺失导致BMP信号机制的结构性上调，这可能影响神经元的存活和成熟，并促进出生后的神经胶质生成。

我们的观察表明嘻哈2−/−突变体包含更多的自噬体，并表现出从P0到P36的突触生长停滞(图8,​,9).9). 一个潜在的促发因素是臀部2−/−突变体可能是pSmad1/5/8在嘻哈2−/−肠神经元(图6). 为了支持这一假设，一些研究表明，BMP直系物、玻璃底舟（Gbb）和BMP II型受体愿望思维（Wit）在果蝇属促进神经肌肉接头的生长和突触稳态(Aberle等人，2002年;McCabe等人，2003年;古尔德和戴维斯，2007年). 此外，TGFβ1还可以调节长时程突触增强、神经元兴奋性和突触蛋白分布海兔属神经元(Zhang等人，1997年;Chin等人，2002年,2006). 在缺乏HIPK2的情况下，BMP信号通路的组成性激活可能会对出生后肠道神经元的突触生长和稳态产生不利影响。最近的几项研究表明，TGFβ和BMP信号除了在调节突触生长方面的作用外，还可以影响正常细胞和癌细胞的自噬诱导(Kiyono等人，2009年;铃木等人，2010年;Xavier等人，2010年). 肠神经元中BMP和/或TGFβ信号通路的扰动嘻哈2−/−因此，突变体可能是这些神经元自噬增加的原因之一。值得注意的是嘻哈2−/−突变体在回肠和结肠中比在近端肠中更显著。虽然这种表型的确切原因尚不清楚，但BMPs的肠内表达可能存在口-直肠梯度(Goldstein等人，2005年)类似于BMP的背腹梯度，有助于前脑和脊髓的模式化(Liu和Niswander，2005年).

最后，我们分析了嘻哈2−/−突变体为帕金森病的发病机制提供了潜在的见解。有充分证据表明，帕金森病患者在疾病进展的早期阶段表现出ENS的症状和路易体病理学，包括外肌层多巴胺能神经元数量减少和多巴胺水平降低(Wakabayashi等人，1990年;Singaram等人，1995年). 突变的α-突触核蛋白存在于帕金森病的遗传形式中，在转基因小鼠中的表达会导致ENS的退行性改变、运动异常以及肠神经元中α-突触核蛋白的聚集(Kuo等人，2010年). 这些小鼠的肠道功能障碍与嘻哈2−/−突变体(图1). 这些观察结果导致了一种假设，即ENS在帕金森病的发病机制和病理生理学中发挥着重要作用(Lebouvier等人，2009年). 尽管有这些令人兴奋的观察结果，但仍然缺乏证据表明帕金森病患者或动物模型中的多巴胺能表型可能与特定的信号机制有关。我们当前和以前的研究结果表明嘻哈2−/−突变小鼠提供了一个有趣的例子，即HIPK2（TGFβ和BMP信号通路中的一个关键信号成分）的缺失导致vMB和ENS中多巴胺能神经元的结构和功能受损(Zhang等人，2007年). 许多先前的研究支持我们的结果，在许多实验范式中，TGFβ与多巴胺能神经元的发育、存活和神经保护有关(Roussa等人，2009年). 需要进一步的研究来确定TGFβ或BMP信号通路的成分是否可以作为治疗靶点来预防或治疗先天性运动障碍综合征或损害ENS功能的获得性疾病，如帕金森氏病。

脚注

这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款NS48393和RR24858（发给E.J.H.）、NS12969和NS15547（发给M.D.G.）以及退伍军人事务部功绩审查奖（发给E.JH.）的支持。我们感谢Moses Chao博士对TrkC抗体的研究，感谢Huang实验室和Gershon实验室的成员进行了许多有益的讨论，感谢哥伦比亚大学神经病学系的David Sulzer博士对手稿的有益评论。

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文章来自神经科学杂志由提供神经科学学会