五种哺乳动物多聚腺苷酸化的定量图谱

PolyA-seq是DGE的准确方法

为了评估PolyA-seq的定量潜力，我们分析了人脑参考和通用人类参考（UHR）MAQC样品(Shi等人，2006年)在技术复制中。我们以百万读数来衡量表达，即与转录本对齐的读数除以实验中唯一对齐的读总数（单位：百万）。由于我们有兴趣证明PolyA-seq是一种用于DGE应用程序的简单方法，因此我们在该分析中使用了所有映射读取，而不是过滤读取（见下文）；然而，使用过滤读取对DGE准确性的影响可以忽略不计（数据未显示）。我们发现再现性很高（大脑技术复制品Pearson第页= 0.994,图2A; 超高辐射技术复制品皮尔逊第页= 0.988). 我们还观察到与qRT–PCR（Pearson第页脑/UHR比值=0.948；图2B). 系统比较应用于MAQC数据的六种表达谱分析方法（qRT-PCR[Shi等人，2006年]、Affymetrix微阵列[Shi等人，2006年]，安捷伦微阵列[Shi等人，2006年]，核糖核酸序列[Bullard等人，2010年]和3′-标签DGE[Asmann等人，2009年])PolyA-seq在比率和绝对基因表达定量方面至少与任何其他方法一样(图2C; 有关详细信息，请参见方法）。在基于比率的比较中，RNA-seq和PolyA-seq与qRT-PCR的一致性最高。受测序吞吐量有限时（例如，多路复用时）这些方法中的一种可能更优越的激励，我们评估了qRT-PCR与随机选择的映射读取子集计算的表达值的相关性。这两种方法的准确度都要低得多，映射读取量不到100万，但在任何输入水平下的性能都没有显著差异(图2D). 这两种方法产生了相似比例的唯一可映射读取（RNA-seq为71%；参见表1对于PolyA-seq）。

表1。

测序深度、对齐分数和产生的polyA位点数量

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图2。

PolyA序列DGE。(A类)从总RNA独立处理的MAQC人脑技术复制品的DGE相关性（Pearson第页= 0.994). (B类)PolyA-seq与MAQC qRT–PCR脑/UHR比值的DGE相关性(第页= 0.948). (C类)MAQC常用表达技术的相关值(Shi等人，2006年)样品。底部,左边对角线的是基于大脑/UHR比率的相关性；顶部,正确的是基于绝对表达式值的相关性（平均值第页大脑对大脑，UHR对UHR）。所有比较数据均已发布：qRT–PCR(Shi等人，2006年)，安捷伦(Shi等人，2006年)和Affymetrix(Shi等人，2006年)微阵列数据(Bullard等人，2010年)，3英尺DGE(Asmann等人，2009年)、NSR(Armour等人，2009年). (D类)Brain/UHR-qRT-PCR的Pearson相关性随着PolyA-seq和RNA-seq映射读数数量的增加而改善。值表示100次随机采样迭代的平均值，误差条表示标准偏差。有关表达式数据处理的更多详细信息，请参见方法。

区分真正的polyA位点与内部启动事件

由于PolyA-seq依赖于一段腺嘌呤的启动，它捕获了转录后添加的PolyA尾部，以及基因组中编码的腺嘌呤的内部（即转录）延伸。EST、全长cDNA、GIS-PET(Fullwood等人，2009年)，PAS-seq(Shepard等人2011)和polyA捕获克隆和测序(Mangone等人，2010年)策略也表现出一定程度的内部启动。在以往努力的基础上再接再厉(Lee等人，2007年)，我们使用读数下游的基因组序列来区分真正的polyA位点和内部启动事件。我们建立了一个经验模型，该模型基于紧邻该位点下游的10个碱基（对应于RT引物的长度）来估计任何给定位点反映真正的多腺苷酸化事件的概率。为了建立模型，我们首先通过实验编制了内部启动事件和真正的polyA位点列表。我们从UHR中生成了PolyA-seq库，但在第一链合成中使用了以10 Ts结尾的寡核苷酸（即无VN）。这导致PolyA-seq读数在A段中随机放置。共有923911个读取包含基因组可对齐的5′端，但以不可识别的As延伸结束，从而定义了28818个独特的真正polyA位点（有关更多详细信息，请参阅方法）。3′端与基因组完全对齐的读数被视为内部启动事件（更多详细信息请参见方法和补充图1）。事实上，其中一些读数可能代表polyA位点，因为T10引物可以偶然杂交到polyA尾部的5′端。然而，我们估计这个比例很小，这些假阴性只能导致低估错误发现（参见方法）。

我们发现内部和polyA位点的启动位点基频之间存在显著差异（补充图1），并使用这些分布构建了一个log-odds评分模型，该模型估计了一个位点真实与内部启动的概率。利用该模型和UHR中的内部启动和polyA事件图，我们将过滤阈值校准为85.6%的灵敏度。在UHR数据集中，这对应于2.5%的假发现率（FDR）（补充图2；参见方法），这也与基于RT-PCR的额外验证一致（补充图3-5）。鉴于所有测序样本的基因组和转录复杂性相似(Chan等人，2009年)，我们预计这一数字将普遍代表哺乳动物样品中的FDR。过滤位点的基频与已建立的基因末端的基频极为相似（补充图6A），我们的模型大大优于之前基于下游腺嘌呤数量的简单过滤(Lee等人，2007年;Shepard等人，2011年)（补充表1；例如，补充图6B）。此外，我们观察到数百个先前报道的可能是内部启动事件的polyA位点（例如，补充图6C）。我们注意到，仅仅使用一个缺少10个末端T的测序引物来识别真正的polyA位点并不能揭示原始的RNA启动位点，因为用于第一链合成的引物被纳入测序库（而不是RNA启动位点）(图1A). 最后，我们注意到，包括一个表示每个站点的读取计数的参数以帮助区分真实站点和内部启动的站点并没有提高性能（数据未显示）。我们推断，真实网站的总体使用率可能更高（即支持它们的阅读次数更多），但事实并非如此。

从数据的视觉检查来看，很明显，已知的polyA位点通常对应于映射到单个位置的主要读数簇，在几个碱基内有几个小峰。这种“摆动”在EST和cDNA比对中也很明显(Fujita等人，2011年)这可能是转录分裂不精确的结果(Proudfoot等人，2002年). 因此，我们将30个碱基内的所有峰聚集在同一条链上，并仅保留每个簇内的最高峰；将该窗口从10 bp变为200 bp不会显著影响位点的数量（补充图7）。表1总结了我们在每个样本中确定的PolyA-seq读取数和PolyA位点数。PolyA-seq的再现性很高；MAQC样品中分别检测到83%和84%的Brain和UHR polyA位点也在相应的技术复制中得到鉴定。

PolyA-seq是精确的，它捕获了所有物种中许多已知的、新颖的和替代的PolyA位点

我们评估了人类地图集的准确性和复杂性，其中转录组被广泛注释（例如，与恒河猴相比），以及我们拥有最多数据的地方（9/24个样本）。共有99.3%的UHR PolyA-seq读数与已知RefSeq 3′UTR重叠（不包括8%与相反链上其他基因重叠的3′UTRs），表明PolyA-seq具有较高的链特异性（如图3A). 绝大多数人类polyA位点与已知的转录末端一致，达到单碱基精度(图3A-C). 在图3B对应于已知的转录末端（更多详细信息，请参见方法），位于上游的位点可能是替代的polyA位点（组织依赖性示例如图3C)在人类中，其数量超过了未标记的转录扩展(图3B).

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图3。

PolyA-seq地图集基本特征评估。(A类)PolyA-seq以特定于股的方式检测PolyA位点。在人类剪接因子中检测到两个polyA位点（垂直尖峰）PTBP1型（正向基因组链，箭头所示）在所有组织中，而LPPR3型（反向链）只有一个polyA位点，仅在大脑中检测到。Y（Y）-轴单位为每百万读数（参见方法；注意年-轴鳞片因组织而异）。正向和反向基因组链上的PolyA-seq位点以不同的颜色显示。(B类)人类位点同意已知转录末端的单基精度。已知末端代表RefSeq、UCSC KG或Ensembl每个基因报告的3′最多的位点。(C类)PolyA-seq揭示了构成性和组织依赖性的PolyA位点。在人体内LGI4（LGI4），polyA位点的选择取决于选择性拼接。即使绝对表达水平波动（参见A类详细信息）。中间位点主要用于肝脏，而下游位点在肾脏中被抑制，但在其他方面表达水平与上游位点相似。(D类)五种人体组织和UHR中polyA位点/3′UTR的数量(n个_{平均值/组织}= 16,387,n个_总uniq= 20,873; 参见3′UTR编译方法）。通过随机选择，将所有样本归一化为相同数量的对齐测序读数。（黑线）这六个样本的聚合数据的站点/3′UTR。(E类)测序读取次数/站点；根据每3′UTR的使用递减顺序来选择位点。(F类)前microRNA转录物的线性依赖性聚腺苷酸化。PolyA-seq检测包含let7a1,let7f1、和让7d在所有物种分析的所有组织中（数据未显示，但更多详细信息请参见补充图8；为简单起见，此处显示的PolyA-seq数据和PolyA信号仅用于人类、恒河猴和小鼠肾脏，并且仅用于感觉链；microRNA前体中的箭头指示转录方向）。在人类和恒河猴中，两个polyA位点（紫色尖峰）对应于两个典型的polyA信号（AATAAA；黑色蜱标记），其中第一个仅存在于灵长类动物基因组中（数据未显示）。在大鼠、小鼠和狗中，根据上游polyA信号的缺失，仅检测到下游polyA位点。(G公司)基因组特征中reads和polyA位点的分布。按照正文中的描述，在每个物种中聚集所有读取数据，然后进行过滤和聚类。

为了探索选择性polyA位点的分布，我们首先对RefSeq注释的3′UTR进行聚类(惠勒等人，2003年)，UCSC已知基因（KG）(Fujita等人，2011年)，并集成到27175个独特的3′UTR模型中（有关更多详细信息，请参见方法）。我们还将每个模型扩展了1kb，以捕获未标记的转录扩展。然后我们询问每个人体组织中每个UTR模型检测到多少个位点。为了进行比较分析，我们通过随机选择将每个人体样本细分为9886234个对齐读取（以匹配人体肌肉），计算了不同的对齐输入读取数。在至少一个人体组织中检测到20873（76.8%）个3′UTR模型；平均而言，46.3%、27.9%和30.7%的UTR有一个、两个和三个或多个检测位点(图3D). 跨组织的聚合阅读揭示了每个基因向更多位点的转移，表明其中许多位点依赖于组织(图3C). 总的来说，占主导地位（利用率最高）的站点的读取量超过90%(图3D)这表明，尽管次要网站普遍存在，但其使用频率往往低于主要网站。

在所有五个物种中，我们观察到与已知polyA位点的极好一致性。大多数PolyA-seq读取映射到已知的polyA位点，尽管大多数polyA地点是新颖的，尤其是在大鼠、狗和恒河猴中，现有的注释没有人类和小鼠的注释广泛(图3G; 有关更多详细信息，请参见方法）。这一结果与我们关于优势位点使用情况的观察结果一致，表明新位点经常在较低水平上使用，并可能解释为什么之前没有报道过它们。低频站点不太可能因误报而丰富，因为在我们的过滤模型中包含一个捕捉站点使用情况的参数并不能提高性能。换句话说，低频站点和高频站点一样可能是真实站点。microRNA簇中灵长类特有的polyA位点如所示图3F发生在保守位点上游75 bp处。

非编码RNA中的聚腺苷酸化

除了检测mRNAs中的多聚腺苷化外，PolyA-seq还捕获多聚腺苷酸化的非编码RNA，包括初级microRNA转录物和反义RNA。例如，polyA位点在许多let-7以及所有或几乎所有组织中的其他微小RNA簇，通过人、小鼠和大鼠的EST证实，但狗或恒河猴的EST不证实，因为在这些组织中EST是稀缺的（例如。，图3F; 补充图8）。肝脏特异性microRNA下游的多聚腺苷酸化MIR122型在肝脏中检出率很高，但在任何其他组织中均未检出（补充图9A）；类似地，MIR124-1型，已知是脑特异性的，主要在大脑中检测到（补充图9B）。在具有丰富EST数据的物种中，如人类和小鼠，EST证实了PolyA-seq位点。在其他物种中，尤其是狗和恒河猴，PolyA-seq通过提供转录的直接证据来补充基于序列保守性的预测。通过PolyA-seq检测到的非编码RNA还包括人类加速区（HAR）转录本HAR1A型和HAR1B型（补充图10A），XIST公司（补充图10B），以及HOTAIR公司（补充图10C），以及反义转录物DLX1（DLX1）（补充图11A）和HOXA11型（补充图11B）。

母题富集分析

我们评估了所有polyA位点150 bp范围内每个组织和所有可能的6-mer的出现频率，并将其与随机选择的相同长度的3′UTR序列中观察到的频率进行了比较(表2). 通过计算，确定了统计上最丰富的前100个六聚体Z轴-使用二项分布的正态近似值对组织和背景之间的差异进行评分。然后通过计算χ评估每个k-mer的位置偏差²统计评估了组织中polyA位点150bp范围内k-mer均匀位置分布的无效假设。每个组织中前10个位置富集的k-mer，以及6-mer在任何提供了polyA位置附近的位置。在所有情况下，这些频率相对于背景高度富集（Fisher精确检验P（P）-值低于所有情况下的计算精度水平）。总共98%的polyA位点与这些六聚体中的一个相匹配，我们观察到这些位点上游的预期富集(图4A). 单个基频(图4B)也支持已知CA二核苷酸在裂解位点的富集(Sheets等人，1990年;Chen等人，1995年).

表2。

在5个人体组织和随机3′UTR背景序列中观察到polyA位点附近的6 mer频率

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图4。

在过滤的polyA位点存在典型的聚腺苷酸化序列信号。(A类)聚腺苷酸化基序位置相对于polyA位点的分布在polyA位置上游20–22 bp处富集，第二峰在10–11 bp处。12个得分最高的六聚体的位置频率(表2)如图所示。大多数序列（98%）与规范序列具有完全匹配或单一失配位点。(B类)在每个碱基上计算的polyA位点周围的平均碱基含量。

PolyA-seq文库准备和测序

将两微升0.1 uM-tailed dT引物T（10）VN与150 ng polyA+RNA混合，最终体积为11μL（所有引物序列和详细方案见补充文件1）。在添加9μL逆转录母体混合物（4μL 5x缓冲液、2μL 10 mM dNTPs、1μL 100 mM DTT、1μL RNaseOUT和1μL SuperScript III酶）之前，将原模板混合物在65°C下加热5 min并在冰上冷却。将20-μL反转录反应在40℃培养90 min，70℃培养15 min，并冷却至4℃。通过添加1μL RNase H（Invitrogen Corp.）降解RNA模板，并在37°C培养20分钟，75°C培养15分钟，然后冷却至4°C。随后使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化DNA，并用65μL洗脱缓冲液洗脱（Qiagen，Inc.）。对于第二链合成，将60μL纯化cDNA添加到40μL Klenow主混合液中（12μL水、10μL 10x NEBuffer 2、5μL 10 mM dNTPs、3μL 5单位/ul exo-Klenow片段；M0212L，New England Biolabs，Inc.）和10μL 10 uM尾随机六聚体引物。将100μL反应在37°C下孵育30分钟，并冷却至4°C。通过与1.8体积的Agencourt AMPure XP珠（Beckman Coulter）孵育5分钟，用70%EtOH洗涤两次，并用50μL洗脱缓冲液洗脱，从第二链反应中纯化DNA。这一步骤大大减少了插入物<40 nt的克隆数。对于PCR扩增，将33μL纯化的第二链合成反应与17μL PCR主混合液（10μL 5x缓冲液2、1μL 25 mM MgCl2、1微升10 mM dNTPs、2微升10 uM正向引物、2微L 10 uM反向引物、1微L ExpandPLUS酶；罗氏诊断公司）。样品在94°C下变性2分钟，然后进行两个94°C循环10秒，40°C循环2分钟，72°C循环1分钟；94°C循环8次10秒，60°C循环30秒，72°C循环1分钟；94°C 15次循环15秒，60°C 30秒，72°C 1分钟；和72°C持续5分钟，以在冷却至4°C之前抛光末端。如上所述，使用AMPure XP珠纯化双链DNA。使用v4试剂在Illumina基因组分析仪IIx上对文库进行测序，并使用Illumiana分析管道（v1.4）调用碱基。PolyA-seq原始读取序列可在NCBI序列读取档案中找到（提交文件SRA039286），而校准和过滤站点可在GEO中找到({“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE30198”，“term_id”：“30198”}}GSE30198标准). 请注意，PolyA-seq读数是反义的。

读取对齐方式

读取是反向完成的，然后与SOAP2对齐(Li等人2009)到各自的基因组和RefSeq基因产生的剪接连接集(惠勒等人，2003年)本研究中使用的所有转录/基因数据库均于2011年5月2日从UCSC下载。EST、GENSCAN和N-SCAN预测的剪接连接也用于实验定义的转录证据不可用的基因组区域。代表了上述基因/转录模型中与单外显子和双外显子跳跃事件相对应的所有可能的剪接连接；每个侧翼外显子序列至少需要5个nt重叠才能考虑比对。将剪接连接比对转换为基因组坐标，并保留唯一比对的读数以供进一步分析。3P系列秀丽线虫读取(Mayr and Bartel 2009年)与BLAT一致(肯特2002)，能够更好地应对3′-A悬垂。

过滤内部启动事件并估计FDR

为了生成真正的polyA位点图谱，我们如上所述对UHR RNA进行了polyA-seq，但使用了以T10结尾的引物而不是T10VN，并以单端模式测序到76 bp。使用BLAT校准读数(肯特2002). 补充图1概述了我们构建过滤模型的过程。5′端完全对齐但3′腺嘌呤（三个或更多）未对齐的病例被认为是真正的polyA位点。如果整个阅读完全一致，则被视为潜在的内部启动事件，不包括具有AAUAAA基序或其变体的位点(Beaudo等人，2000年)在−40到−10 nt和/或与RefSeq转录本或EST的3′端重叠的位点（距离末端±10个碱基）。启动位点基频的两种分布用于生成log-odds模型，其中

个人账户和我分别是真正的polyA位点和内部脉冲基频。x个_我(A类_我，C_我，G_我，T型_我)表示位置处的基本标识我在评估的下游场地内，其中A类_我，C_我，G_我，T型_我,是位置处As、Cs、Gs和Ts的频率我因此，任何10个碱基的序列都可以用来计算polyA得分，并且在UHR T10VN数据上的性能非常好。测试集包括22551个与上述真正polyA位点一致的位点（阳性）和15530个与内部启动事件一致的位点。在评分阈值为3.0时，我们在测试集上获得了85.6%的敏感性和97.5%的特异性（1-假阳性率）。

估计假发现率（FDR；所有预测的polyA位点不正确的比例）比确定假阳性率（FPR；错误调用的已知阴性的比例）更具挑战性，因为它需要了解验证测试集以外的位点。理想情况下，人们可以知道所有内部启动位点的位置，并且可以直接测量FDR，因为它与FPR完全相同。尽管如此，如果测试集中的阳性与阴性比率反映了完整集合（即基因组）中真实的潜在比率，则可以从测试集中估计FDR。换句话说，如果从基因组中随机抽取polyA位点和内部启动事件来构建测试集，则FDR可以估计为1减去精度[即所有预测阳性的正确比例，或TP/（TP+FP）]。对于我们的测试集来说，缺少抽样偏差是正确的；polyA位点与内部启动位点的比率为1.45（22551/15530），真正polyA部位与内部启动延伸的比率（从T10读数测量）为1.61（92万个为真正的polyA位点的读数加上570万个大于98%的As且可能来自polyA尾部的读数，除以410万个可能是内部启动事件的读数；参见补充图1）；1.61大于1.45，因此，我们通过该系数降低了估算FDR的精度（补充图2D）。在polyA得分阈值为3.0时，我们估计FDR为2.5%。

与已知polyA位点的比较

已知转录终点坐标(图3B)根据RefSeq、UCSC KG和Ensembl转录模型编译而成（从UCSC下载）(Fujita等人，2011年)，取转录亚型重叠在同一基因组链上时的3′-最大位点。已知3′UTR坐标(图3D，E)还通过将重叠的亚型（在同一链上）折叠为代表基因组坐标联合的单个3′UTR模型，从RefSeq、UCSC KG和Ensembl转录本编译而来。来自这些转录源的122215个UTR被分解为27175个UTR模型，其中20873个在至少一个人类样本中检测到（每个组织中平均检测到16387个）。以前报告的polyA位点(图3G)由PolyA-DB2编译而成(Lee等人，2007年)，数据库EST(Boguski等人，1993年)、GenBank mRNA(惠勒等人，2003年)，UCSC已知基因(Fujita等人，2011年)，RefSeq基因(惠勒等人，2003年)和集成基因(Flicek等人，2011年). 坐标从UCSC获得(Fujita等人，2011年)可用时，或使用BLAT与相应基因组对齐(肯特2002)（使用默认设置并采用最佳对齐方式）。