胰腺肿瘤形成前的EMT和播散

癌前病变的EMT

EMT被认为是癌细胞侵袭和扩散的先决条件(Hanahan和Weinberg，2011年). 为了确定在PanIN-To-carcinoma进展过程中何时首次出现EMT，我们分析了8-10周龄的PKCY小鼠。在这些时间点，仅存在癌前PanIN病变，根据广泛的H&E分析，没有PDAC的组织学证据（n=18）；这些动物被称为“PanIN小鼠”，只是为了反映这些时间点胰腺的组织状态。

在两种模型的癌前病变中均发现EMT(图2B–C,补充图1BC，数据未显示）。2.7%和6.8%的PanIN 2和3病变中至少含有一个YFP⁺Zeb1号机组⁺而在PanIN 1病变中从未观察到EMT(图2A、E). 其他间充质标志物也有类似结果，包括Fsp1、Slug、Snail1和Sip1(补充图1). EMT在腺泡-导管化生（ADM）区域也很常见，尤其是在周围有大量炎性细胞的病变中(图2D,补充图2A). 我们将这些区域称为ADMIs（伴有炎症的腺泡到导管化生），并确定15.8%的ADMIs在8-10周大的PKCY PanIN小鼠中有EMT的证据(图2E).

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图2

EMT先于肿瘤形成

（A–D）在8–10周龄PKCY小鼠的胰腺中，在伴炎症的腺泡-导管化生区域（ADMI；D）、PanIN 2（B）、PanIN3（C）观察到EMT，但在PanIN 1病变区域（A）没有观察到。箭头显示单个YFP⁺也表达Zeb1（红色）的细胞（绿色）。（E） A–D观察结果的量化，显示每种类型的病变中至少有一个细胞经过EMT的百分比；这些数字反映了五只PanIN小鼠中每只都有至少10个中等能量场。（F） 隔离YFP的策略⁺胰腺上皮细胞；YFP的纯度⁺人群通过重复的FACS分析得到证实。（G） 分类YFP的转录分析⁺来自谱系标记的CY对照（n=4）、PanIN（n=6）和PDAC（n=5）胰腺的胰腺细胞。在本图和后续图中，条形图数据表示为平均值±SD。*，p<0.01；**，除非另有说明，否则通过本图和后续图中的双尾Student t检验，p<0.001。比例尺，20μm。另请参见图S2.

我们通过对YFP进行分类，证实上皮源性胰腺细胞在转录水平激活了间充质程序⁺细胞和进行qPCR(图2F). 在YFP中发现了Zeb1、Fsp-1和N-cadherin的转录本⁺来自荷瘤PKCY动物和PanIN动物但不在YFP中的细胞⁺CY对照小鼠的细胞(图2G; p<0.01）。这些数据表明，EMT发生在PanIN病变和ADMI肿瘤形成之前。

胰腺上皮细胞在肿瘤形成前扩散

经历EMT的细胞获得侵袭性表型在体外(波利亚克和温伯格，2009年). 因此，我们假设在PanIN小鼠中经历EMT的细胞也可能具有侵袭性。根据这一概念，我们确定了个人YFP⁺在患有PanIN 2和PanIN 3损伤的小鼠中，穿过基底膜并从任何可辨别的胰腺上皮结构中分离出来的细胞（我们称之为“分层”过程）(图3A,补充图2A). 大多数细胞表达Zeb1(图3Ai–iii)并且获得了成纤维细胞样的形态，使得它们与周围的基质细胞在常规组织学上无法区分(图3A-B;补充图2); 分层YFP的一部分⁺细胞也表达Fsp1(补充图2A，插图）。为了排除Pdx1页在癌前进展期间，启动子可能在间充质细胞中被外周激活，我们在米斯特1^{CreERT2公司}用三苯氧胺脉冲标记腺泡细胞的小鼠。在实验性胰腺炎的背景下（如下所述），薄雾1^{CreERT2公司};喀斯特^G12D系列;罗莎^YFP公司含胰腺成纤维细胞样YFP⁺缺乏E-cad表达的细胞(补充图2B). 因为薄雾1^{CreERT2公司}仅在服用他莫昔芬时调节标签(Habbe等人，2008年)，该实验明确证明标记的间充质细胞来源于胰腺腺泡细胞体内.

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图3

肿瘤形成前的造血扩散和肝脏播散

（A和B）显示单个YFP的图像⁺10周龄PKCY PanIN小鼠（a）肿瘤形成前，细胞（绿色）与基质细胞混合。分层YFP⁺细胞具有纺锤形形态并表达Zeb1（框i–iii）；它们与周围的Zeb1无法区分⁺YFP公司⁻相邻切片的H&E染色显示基质细胞（B）。（C和D）年龄匹配的CY对照组（C）和PKCY PanIN小鼠（D）血液样本的FACS分析。YFP荧光和白细胞标记CD45染色显示在FACS图的X和Y轴上。YFP公司⁺CD45型⁻在PanIN（D）和PDAC（未显示）动物的血液中观察到细胞（方框区域表示代表性门控和YFP的绝对数量⁺单元格）。（E） 循环YFP的量化⁺胰腺细胞（CPC）。平均CPC数（每毫升血液）为3.65±3.76（CY对照，n=13）、32.8±26.2（PanIN，n=17）和97.3±48.9（PDAC，n=18）（p<0.001）。（F–G）显示分选的YFP的落射荧光的相位荧光图像⁺单元格。（H） 基因组PCR显示YFP中存在重组YFP等位基因⁺单元格，但不是YFP⁻细胞。含有重组等位基因的胰腺DNA作为阳性对照。（一） 转录本编码的表达YFP公司,Pdx1型、和电子cad，比较排序的YFP⁺和YFP⁻细胞，qPCR测定（±SD）。cDNA PCR扩增后的（J–K）Sanger测序显示YFP⁺CPC表达突变喀斯特包含改变密码子12的等位基因（G→A，突出显示）。来自8-10周龄PKCY动物的（L–N）CPC为肝脏播种。（L） 荷瘤小鼠肝脏中的微转移（“PDAC肝脏”）。（M和N）单个CPC在PanIN阶段播种肝脏（“PanIN肝脏”）；血管管腔的轮廓。比例尺，A–B为40μm；L–N为5μm。另请参见图S3.

为了扩展这些研究，我们对Pdx1转录因子进行了免疫染色。Pdx1通常在胰腺发育期间和成人β细胞中高水平表达，在人类PanIN病变和PDAC中通常“再激活”(Park等人，2011年). Pdx1在PanIN病变和YFP亚群中广泛表达⁺PanIN小鼠中分层的细胞(补充图3A). 与这些数据一致，含有PanIN病变（但没有肿瘤）的人类胰腺切片显示出分散的Pdx1⁺从任何确定的上皮结构中分离出来的细胞(补充图3B–D). 因此，人类胰腺细胞可能会像在小鼠模型中那样从PanIN损伤中分层。

由于谱系追踪证明胰腺细胞可以在标准组织学检测到侵袭行为之前穿过基底膜，因此我们询问这些细胞是否也可以在肿瘤形成之前进入血流。在荷瘤PDAC小鼠中，YFP⁺用流式细胞术很容易在血液中检测到循环胰腺细胞(图3E). 令人惊讶的是，8-10周龄PKCY-PanIN小鼠的血液中也富含CPC(图3C-G). 排序的YFP⁺含有重组YFP等位基因的细胞(图3H)，表达YFP、Pdx1和E-cad的转录本(图3I)并在第12密码子携带Gly→Asp突变喀斯特cDNA(图3J–K). 因此，来自胰腺上皮的细胞存在于小鼠的循环中，没有证据表明存在癌症。

这些数据增加了来自PanIN小鼠的CPC可能为远处器官播种的可能性。为了评估这种可能性，我们首先检查了PDAC小鼠作为阳性对照。亮场立体显微镜可检测8/20只动物的肝和肺转移；YFP谱系标签的使用增强了检测，揭示了16/20 PDAC小鼠的微介导酶(图3L). 接下来，我们分析了8-10周龄的PKCY-PanIN小鼠。虽然没有动物具有宏或微介导酶，但YFP的肝脏接种⁺在4/11 PanIN小鼠中检测到细胞(图3M–N); 大多数是位于血管附近的单细胞，既不表达Zeb1也不表达E-cad(图3M–N). 相比之下，来自谱系标记对照CY小鼠的0/10肝脏中含有YFP⁺用同样的技术检测细胞。

CPC特征

YFP的数量⁺PDAC小鼠的CPC取决于血液采集的位置，与左侧相比，右侧心脏的CPC数量大约增加了三倍(图4A). 只有2/9只PDAC小鼠有肺转移的证据，表明绝大多数CPC无法通过肺循环存活。为了确定循环中的细胞是否表现出上皮、间充质或混合表型，我们在流式细胞术分析中用多种标记物对CPC进行染色。在不到20%的PanIN CPC和不到40%的PDAC CPC中检测到上皮标记物E-cad、CK19和EpCAM(图4B). 除Fsp1外（Fsp1仅在所有PanIN CPC中检测到1.1%，而在PDAC CPC中为45.2%（p<0.01）），两组CPC之间的细胞表面表型没有统计学上的显著差异(图4B). Zeb1和EpCAM的共同免疫荧光显示，约40%的PDAC CPC是Zeb1⁺，27%为EpCAM⁺，18%为双阳性(补充图4)这表明大多数CPC不表现出“混合”上皮-间充质表型。这些数据表明，PDAC和PanIN动物的CPC在表型上相似，大部分在循环中保持间充质表型。

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图4

CPC表征

（A） 从同一动物（n=3）的左心房或心室（左）或右心房或心室取样后对CPC进行量化。（B） 从PanIN或PDAC小鼠获得的CPC中的上皮和间充质标记物的FACS染色定量（每个数据点n=6-8）。（C和D）YFP的量化⁺PKCY PanIN和PDAC小鼠胰腺（C）和循环（D）中的细胞，对推测的胰腺癌干细胞标记物CD24和CD44呈阳性染色。（E和F）YFP存活（E）或克隆生长（F）的量化⁺从超低附着孔中的谱系标记对照（CY）、PanIN和PDAC小鼠获得的细胞。柱状图显示了显示任何活YFP的井数（在96个播种有单个细胞的井中）⁺细胞（E，插图）或克隆生长迹象（F，插图）。显示了成对双尾Student t检验的p值。比例尺，10μm。另请参见图S4.

CPC具有肿瘤干细胞的特征

癌症干细胞在功能上被定义为在移植到允许的宿主中时具有增强的肿瘤启动能力的细胞。在人类胰腺肿瘤中，这种活性可能包含在CD24中⁺CD44细胞⁺细胞数量等(赫尔曼等人，2007年;Jimeno等人，2009年;Li等人，2007年). 由于原代细胞中的EMT与获得干细胞样特征有关(Mani等人，2008年)，我们假设CPC也可能表现出癌症干细胞的特征。我们比较了CD24的相对丰度⁺CD44细胞⁺来自PanIN和PDAC小鼠的胰腺和CPCs中的细胞。通过FACS分析，分选YFP的0.11±0.32%和0.30±0.13%⁺PanIN和PDAC胰腺细胞分别表达CD24和CD44(图4C). 相比之下，分类YFP的23.1±12.9%和46.4±14.7%⁺来自PanIN和PDAC样品的CPC被发现是CD24⁺CD44细胞⁺与源胰腺相比，其富集程度超过100倍(图4D).

接下来，我们通过使用一个在体外胰腺分析，其中单个YFP⁺细胞在无附着条件下培养(Rovira等人，2010年). 在PanIN和PDAC小鼠中，YFP⁺与YFP相比，CPC的克隆存活率和生长率显著提高⁺同一动物的胰腺细胞(图4E-F; p<0.05）。综上所述，这些数据表明，在肿瘤进化过程中体内，血液进入与具有与胰腺癌干细胞相关的表型和功能特征的细胞的富集有关。

经历EMT的细胞具有肿瘤起始特性

虽然先前的研究表明EMT和肿瘤侵袭性增加之间存在联系，但大多数研究都依赖于在体外操纵癌细胞系诱导EMT(温伯格，2008). 这些治疗除了对EMT诱导活性有直接影响外，还可能对细胞行为产生直接影响，因此缺乏EMT在肿瘤进展中作用的直接证据。我们使用我们的谱系标记系统来分离失去或保留E-cadherin表达的细胞，以确定EMT体内与肿瘤起始能力有关(图5A).

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图5

上皮和间充质状态是可塑的

（A） 原位移植实验示意图。移植YFP后3周的荧光图像⁺将PDAC小鼠的细胞转化为NOD/SCID宿主。肿瘤在所有小鼠中形成，而与E-cad状态无关（每种情况n=5）。YFP公司⁺电子cad⁺和YFP⁺电子cad⁻细胞在两种条件下都存在（C和E），YFP也是如此⁺Zeb1号机组⁺和YFP⁺Zeb1号机组⁻细胞（B和D）。（F–I）YFP移植后8周的荧光图像⁺将PanIN小鼠的细胞转化为NOD/SCID宿主。YFP移植后⁺电子cad⁺细胞，未发现肿瘤（n=6）；少数移植YFP⁺剩下的细胞是Zeb1⁻和E-cad⁺（F、G）。YFP移植⁺电子cad⁻细胞导致肿瘤形成（H，I）。肿瘤包含E-cad⁺和E-cad⁻细胞（I）和Zeb1⁺和Zeb1⁻细胞（H），为MET提供直接证据。

首先，我们移植了10万日元⁺电子cad⁺或YFP⁺电子cad⁻PDAC小鼠的胰腺细胞进入NOD/SCID动物的胰腺（每组5个）。三周后，无论移植时的E-cad状态如何，所有移植都会产生局部侵袭和远处转移的大肿瘤；肿瘤组织学相似，YFP⁺两组共表达Zeb1或E-cad的细胞比例相当(图5B–E). 这一结果表明肿瘤衍生的E-cad⁺和E-cad⁻每个细胞都可以形成肿瘤，上皮和间充质状态之间存在显著的可塑性。

相比之下，我们观察到移植PanIN小鼠细胞时，E-cad状态对肿瘤形成的显著影响：4/6只动物移植了100000 YFP⁺电子cad⁻当0/6只动物移植10万YFP时，两个月后细胞形成肿瘤⁺电子cad⁺细胞在同一时间段内形成肿瘤(图5F–I). E-cad衍生的肿瘤⁻PanIN细胞在E-cad和Zeb1表达方面是异质的(图5H–I). 通过比较，E-cad⁺移植动物几乎没有检测到YFP⁺两个月时间点的单元格，以及几乎所有YFP⁺检测到的细胞为Zeb1⁻(图5F). 小鼠移植E-cad⁺PanIN细胞最终发展成肿瘤（移植后平均潜伏期为四个月），与PDAC衍生肿瘤无明显区别。因此，肿瘤起始能力的功能分析表明E-cad⁻经历EMT的细胞在PanIN阶段具有显著优势。

EMT、MET和获取干细胞特征

血统追踪使我们能够区分获得间充质特征的胰腺细胞和保留上皮表型的胰腺细胞。大多数从上皮层剥离的标记细胞（即局部浸润细胞）表达Zeb1，表明它们经历了EMT。侵袭行为与间充质特征的获得之间的密切关系体内这表明EMT不仅是一种副现象，而且代表了一个关键的障碍，细胞必须清除这个障碍才能逃离其上皮邻居。目前，在高级PanIN和ADMI中启动EMT的信号体内尚待确定。

根据EMT状态（即YFP）分离PDAC细胞时⁺电子cad⁺或YFP⁺电子cad⁻)并将其原位移植到胰腺，所得肿瘤的上皮和间叶成分相似。这一结果表明，上皮或间充质表型不是恶性细胞的稳定特性，并为间质-上皮转化（MET）提供了直接证据体内我们还注意到原位移植YFP⁺电子cad⁻8-10周龄PKCY-PanIN小鼠的细胞产生肿瘤的潜伏期比相同数量的YFP小鼠短得多⁺电子cad⁺细胞。对这一结果的一种解释是，在PanIN阶段经历EMT的细胞更有致瘤性；或者，YFP⁺电子cad⁻人群可能会因具有更大或更快速的致瘤特性的细胞子集而丰富。无论哪种情况，我们的研究结果都突出了肿瘤进展过程中上皮和间充质状态之间存在的显著可塑性程度体内.

在PKCY模型中，带有CD24的细胞⁺CD44细胞⁺表型-通过异种移植检测具有肿瘤起始特性的人群(Li等人，2007年)–与胰腺相比，在循环中显著富集。因此，循环细胞在低附着状态下表现出更高的存活率和自我更新能力。因此，我们的发现提供了体内支持EMT与干细胞计划启动相关的概念(Mani等人，2008年)并表明收购CD24⁺CD44细胞⁺表型有助于进入血液循环和/或存活。

识别患者循环肿瘤细胞（CTC）技术的发展代表了转移研究的巨大进步(Pantel等人，2008年). CTC数量与许多癌症的临床结果和对化疗药物的反应相关(Cristofanilli等人，2004年)并且可以检查孤立的播散细胞是否存在与死亡风险增加相关的分子变化(Stoecklein等人，2008年). 因此，CTC生物学既有临床应用价值，也有潜力促进我们对转移级联的理解。然而，分离CTC的标准技术在很大程度上依赖于使用上皮标记物，尤其是EpCAM进行检测(Pantel等人，2008年). EpCAM阴性YFP的存在⁺我们研究中的CPC提出了几种可能性：1）使用上皮表位的标准方法可能无法捕获所有CTC；2） 细胞可能在经历“不完全”EMT后进入循环，其中EpCAM的残余表达保持不变，但流式细胞术检测不到；或3）CTC可能以间充质表型进入血流，随后通过MET过程“恢复”为上皮表型。

细胞染色

对于涉及流式细胞术和胰腺细胞分类的实验，至少保存25%的组织用于组织学分析，并按照补充实验程序.

我们感谢I.Ben-Porath、A.Minn、A.Rustgi、M.C.Simon、L.Chodosh和H.Zong提供的有益讨论，感谢M.Emmett、A.Pannikar和M.Rovira提供的技术援助，感谢N.Bardeesy、R.DePinho、S.Konieczny和D.Melton提供的小鼠菌株，感谢J.Habener和D.Melt提供的抗体。我们感谢R.Hruban提供组织学印模的确认。这项工作得到了NIH（DK088945和DK007066到ADR，CA143292到AM和SDL，CA138907到GLB，DK083355和DK083111到BZS）、AGA/FDHN（ADR）、国家胰腺基金会（ADR和MR）、AACR和胰腺癌行动网络（JMB获得领导途径奖，BZS获得职业发展奖）的支持，宾夕法尼亚州卫生部和皮尤慈善信托基金会。实验利用了NIH/PEN消化和肝脏疾病分子研究中心（P30-DK050306）、Abramson家族癌症研究所和糖尿病和内分泌研究中心（P10-DK19525）的分子病理学和成像、分子生物学和细胞培养核心设施。