波形蛋白组织调节跛足的形成

波形蛋白的分解和收缩伴随着血清饥饿细胞中跛足的诱导

当成纤维细胞被剥夺血清24-72小时时，跛足形成的频率降低，大多数细胞的细胞边缘变得更加僵硬(图1D). 更具体地说，Arp2/3染色显示，无血清3T3成纤维细胞分别有65%（n=100）和80%（n=100h）在48和72小时后无跛足（数据未显示）。相反，在含有血清的培养基中，大多数细胞（90%；n=100）呈现皱褶膜/跛足。无血清72小时后，VIF网络主要由长纤维组成，似乎从核周区延伸到细胞外围(图1，E和F)细胞质中只可见少量颗粒和短丝。在添加血清后的1分钟内，长VIF开始收缩，并与细胞表面开始起皱的区域失去紧密联系。与VIF的快速重组相一致，数秒内出现大量波形蛋白颗粒，数分钟内出现波形，这两种结构都分散在板层和板层的形成中。添加血清后30分钟，在含有领先的跛足的细胞内，不同形式的波形蛋白的分布与维持在正常生长介质中的细胞没有区别(图1，G–I). 添加血清后，活成纤维细胞中表达的翡翠-维酮重组的观察结果支持了这些发现，因为在几分钟内，长VIF从细胞表面向核区域收缩(图2，D–I). 在VIF仍与细胞表面相关的区域，未观察到膜皱褶。由于已知VIF的细胞内运动在很大程度上受到与微管和微丝相关的马达的调节，我们还检测了在这两种细胞骨架系统的抑制剂存在的情况下，VIF对血清的回缩反应。在添加血清之前，诺卡唑被用于破坏血清饥饿细胞中的微管（参见材料和方法). 添加血清后，随着整个细胞表面开始起皱，VIF网络向核周区域整体收缩。这表明VIF的逆行不需要微管（数据未显示；Goldman等人。,1996). 在存在肌动蛋白抑制剂latrunculin A或细胞松弛素B的情况下，VIF保留在细胞表面，添加血清后膜皱褶不明显（Hollenbeck等人。,1989).

VIF的动态特性和磷酸化在跛足足形成过程中发生改变

通过FRAP测定血清饥饿的成纤维细胞和添加血清后表达GFP-波形蛋白的细胞沿VIF的亚单位交换。缺乏血清的细胞荧光恢复明显较慢（t_½=12.1±2.4 min，n=10），与添加血清后5-10 min观察到的细胞相比（t_½=5.7±1.9分钟，n=10；p<0.001）。与亚单位交换速率增加有关的一个可能因素是波形蛋白磷酸化，它调节IF蛋白的组装状态、组织和动态特性（Sihag等人。,2007; Hyder公司等人。,2008). 血清添加后激活的激酶包括Rho激酶、蛋白激酶C（PKC）、AKT和PAK，所有这些激酶都磷酸化波形蛋白Ser-38（Ando等人。,1989; 小迫等人。,1997; 转到等人。,2002; 埃里克松等人。,2004; 朱等人。,2011). 定量免疫印迹证实，加入血清后，Ser-38迅速磷酸化，在第一分钟内增加了约350%。这种磷酸化水平持续60分钟(图3A)与在正常血清中生长的细胞相比较（数据未显示）。为了确定这种快速增加的Ser-38磷酸化是否可逆，72小时的血清饥饿细胞暴露于30分钟的血清脉冲中，然后返回无血清培养基。取血清后30分钟，pSer-38波形蛋白水平显著降低，120分钟时，波形蛋白–Ser-38磷酸化与72小时血清饥饿细胞相似(图3B). 添加血清后细胞的免疫荧光观察证实了这些结果(图3，D–L)并证明了VIF以及波形蛋白的歪歪扭扭和颗粒(图3，J–L)在添加血清后不到1分钟内，在Ser-38处磷酸化。另一种磷酸表位特异性抗体，波形蛋白pSer-82（Izawa和Inagaki，2006)，在血清刺激后通过免疫荧光或免疫印迹显示无反应（数据未显示）。有趣的是，尽管Ser-38磷酸化似乎在整个VIF网络中发生，但VIF网络的分解和收缩只发生在细胞表面附近的某些小区域内(图3，G–L). 通过对富含IF的细胞骨架制剂的颗粒和上清液组分的分析，证实了这种局部VIF分解，这表明在使用抗波形蛋白或抗pSer-38的血清添加后，可溶性波形蛋白的量没有可检测到的差异(图3C以及未显示的数据；Yoon公司等人。,1998). 因此，我们寻求一种技术，使我们能够以更本地化和可控的方式检查vimentin组装状态中的更改，如本文后面所述。

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图3：

添加血清后，波形蛋白-Ser磷酸化增加。（A） 免疫印迹显示，加入血清后1分钟内，波形蛋白Ser-38的磷酸化显著增加，持续时间长达60分钟。波形蛋白和肌动蛋白用作负荷控制，pSer-38印迹暴露的时间足以显示0分钟的信号。（B）血清激活后血清耗竭后波形蛋白-Ser-38磷酸化的时间进程。细胞被血清饥饿72小时（泳道标记为−S）；添加血清30分钟（+S），然后将细胞替换到无血清培养基中，并在指定时间（5–240分钟）制备细胞裂解物。（C） 血清饥饿后（72 h）或血清刺激后10 min和60 min，颗粒和上清液组分之间的波形蛋白分布没有差异。（D–F）带有抗波形蛋白（D）和抗波形素pSer-38（E）的双标记免疫荧光显示，该残基在缺乏血清的3T3细胞中磷酸化程度最低（72小时；F，重叠）。（G–I）添加血清10分钟后，在3T3细胞中用抗波形蛋白pSer-38染色。请注意，整个VIF网络都被这种磷酸特异性抗体染色（G，抗波形蛋白；H，抗波状蛋白pSer-38；I，覆盖；10分钟）。（J–L）（G）中方框表示的区域放大倍数较高，表明pSer-38也存在于形成跛足的区域的颗粒和波形中。棒材=10μm。

Rac1激活后重组Vimentin

利用光活化Rac1（PA-Rac1）测定了跛足足形成过程中VIF的动态特性，该Rac1可用于诱导跛足足的形成（Fukata等人。,2003; 吴等人。,2009). 表达PA-Rac1的非辐照血清饥饿成纤维细胞没有跛足，并且包含延伸至细胞表面的VIF网络(图4，A–D; n=50）。免疫荧光研究表明，通过将整个培养皿中缺乏血清的细胞暴露在光照下，激活PA-Rac1后5-10分钟内，VIF已从细胞表面撤回(图4E)当Arp2/3-富集的跛足在整个细胞周围变得明显时(图4G; n=50）。波形蛋白颗粒明显存在于这些细胞的板层和板层区(图4F).

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图4：

PA-Rac1激活诱导波形蛋白重组。（A–D）双标记免疫荧光显示，VIF网络延伸至稳定表达PA-Rac1（A，波形蛋白；B，A中星号附近区域放大倍数较高）的无血清（72 h）mEF中的细胞外围。如抗Arp2/3（C，Arp2/3；D，覆盖）染色所示，这些细胞没有跛足。（E–H）全细胞照射后10分钟内，VIF从细胞边缘消失（E，抗波形蛋白；F，E中星号附近区域的放大倍数较高）。如Arp2/3染色（G，Arp2/3；H，重叠）所示，这种回缩与包围整个细胞的片状足的形成一致。波形蛋白颗粒明显存在于板层和板层（E，F）中。细胞被固定在甲醛中，以保持板足动物体内富含肌动蛋白的结构，而不是甲醇，因为甲醇是波形蛋白的最佳固定剂（参见材料和方法). 棒材（D，H）=10μm。（一） Rac1在表达翡翠色素和PA-Rac1的血清缺乏（72小时）3T3细胞区域的局部激活。该区域包含相对较少的VIF，朝向细胞表面。在单次照射脉冲（红圈）后的几分钟内，开始局部膜褶皱（I，照射后以指定的时间间隔进行相位对比和Emerald波形蛋白覆盖）。随着跛足的形成，VIF网络似乎被分解并从细胞表面缩回（参见补充视频S2）。（J） 血清饥饿（72小时）的3T3细胞稳定表达PA-Rac1，并瞬时表达翡翠色素。VIF的厚束明显平行于细胞边缘。在仅照射该区域后，这些束似乎会从细胞表面展开和收缩。这与波形符号和粒子的形成一致，其中许多快速移动出视野（移动波形符号见星号；另见补充视频S3；顶行，按指定时间间隔拍摄的荧光图像；最下面一行，相同的图像叠加在相位对比上，以显示扩张的跛足区域）。棒材（I，J）=5μm。

PA-Rac1结构的一个主要优点是，它也可以在单个细胞的特定亚细胞区域被激活，以局部诱导跛足的形成（Wu等人。,2009). 因此，我们对共表达mCherry-PA-Rac1和Emerald波形蛋白的活的、血清饥饿的3T3成纤维细胞进行了光活化。PA-Rac1的局部激活导致照射区域内和附近VIF的收缩(图4I; 参见补充视频S2）。有趣的是，我们发现诱导皱褶所需的光脉冲数取决于靠近细胞表面的VIF密度。在包含少量VIF的地区（请参阅图4I)诱导跛足只需要一次脉冲，这与VIF的回缩和解体相一致。相反，如果VIF束较厚，则需要10-30个脉冲(图4J; 另请参阅补充视频S3）。在所有情况下，VIF向原子核的撤回都伴随着它们的解体，正如波形符号数量增加所表明的那样，撤回的VIF使该区域中的一些粒子空出。对细胞外周VIF束的详细观察表明，它们的回缩伴随着明显的退缩和松动，产生较薄的纤维和波形，而后者随后离开束(图4J和补充图S3）。PAK被Rac1激活，并在Ser-38磷酸化波形蛋白（Goto等人。,2002). 因此，我们确定表达PA-Rac1的整个mEF细胞的光激活是否也会诱导Ser-38处波形蛋白的磷酸化。对转染PA-Rac1的细胞的免疫荧光观察显示，在全细胞PA-Racl激活的1-2分钟内，波形蛋白pSer-38染色显著增加(图5，A–C)而同一盖玻片上不表达PA-Rac1的相邻细胞则表现出较少的波形蛋白pSer-38。波形蛋白磷酸化总是发生在明显的膜皱褶之前。对从辐照或未辐照的稳定表达PA-Rac1结构的mEF培养物中获得的全细胞提取物的定量免疫印迹分析表明，在光照后10分钟内，波形蛋白pSer-38增加了约400%(图5D).

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图5：

PA-Rac1的激活诱导波形蛋白-Ser磷酸化。将（A–C）瞬时表达PA-Rac1的mEF血清饥饿72小时，然后在用针对波形蛋白（B）和波形蛋白pSer-38（C）的抗体固定和染色之前照射整个盖玻片。表达PA-Rac1的细胞通过其mCherry标签进行识别（数据未显示；用星号表示的细胞，参见材料和方法). 请注意，VIF已从表达PA-Rac1的mEF（A，B）的外围收缩，并且在Ser-38（C）处磷酸化。相比之下，VIF在不表达PA-Rac1（没有星号的细胞）的相邻细胞中没有重组。免疫印迹显示，对稳定表达PA-Rac1（D，波形蛋白pSer-38）的细胞的无血清培养物进行照射后（72 h），pSer-39显著增加。稳定表达PA-Rac1的（E–P）mEF也进行点照射，然后固定并在指定的时间间隔进行免疫荧光处理。在光活化后立即固定的细胞中，VIF在照射区域内或仅在照射区域附近被Ser-38磷酸化（见红圈；E，相差；F，波形蛋白；G，波形蛋白pSer-38；H，重叠；插图显示照射区域）。在10–20 s内，波形蛋白pSer-38的区域已经从照射点扩散开来（I，相位对比；J，波形素；K，波形肽pSer-38,L，覆盖），到45–60 s，波形酶pSer-38-在整个VIF网络中都很明显（M，相位对比度；N，波形质；O，波形蛋白pSer-38；P，覆盖）。棒材=10μm。

为了更好地理解Rac1活化和波形蛋白磷酸化之间的空间关系，我们局部照射PA-Rac1表达的成纤维细胞中直径约为10μm的斑点，并观察Ser-38处波形蛋白磷酸化的变化。光活化后，照射部位VIF上Ser-38的磷酸化立即显著增加(图5，E–H). 光活化后10–30 s内的固定显示，磷酸化区域似乎沿着波形蛋白网络从照射部位扩散开(图5，I–L). 最后，在辐照直径为～10-μm的斑点后1分钟内，与未辐照细胞相比，整个VIF网络显示Ser-38磷酸化增加(图5，M–P).

VIF的靶向性分解诱导跛足的形成

上述结果表明，细胞边缘的VIF网络抑制了跛足的形成。为了进一步验证这一假设，我们使用了一个显性-阴性模拟肽2B2。该肽源于中央杆状结构域的C末端（残基355–412），已证明在体外抑制VIF的组装（斯特列科夫等人。,2002). 我们在这里表明，通过负染电子显微镜测定，2B2肽也可以在体外驱动聚合VIF的分解(图6，A–C). 在添加2B2肽后的10秒内开始分解，导致在剩余的长VIF旁边出现短纤维(图6B). 5分钟后，VIF几乎完全分解为类ULF结构，偶尔出现短灯丝(图6C). 为了确定2B2肽对体内VIF网络的影响，将3T3细胞进行72小时的血清饥饿处理，然后微量注射2B2肽类，每隔180分钟通过免疫荧光进行研究。在注射缓冲液中的浓度高于5μg/ml时，微量注射2B2肽导致细胞聚集并从底物上脱落，正如我们之前报道的Vim-1A肽的情况（数据未显示；Goldman等人。,1996). 然而，当注射缓冲液中的浓度为2.0μg/ml时，很明显扩展的VIF网络从细胞外围消失，但仍有一些VIF保留在相邻区域(图6D). 此外，大量颗粒留在细胞质中，特别是在细胞表面形成跛足的区域富集(图6D，插图）。微量注射低浓度2B2的缺血清细胞（注射缓冲液中0.5μg/ml）通常会导致VIF从细胞表面局部收缩，这与注射部位附近形成跛足相一致。Arp2/3抗体染色证实在VIF重组的所有细胞中均诱导了跛足(图6E; n=100）。相反，微量注射搅打肽(图6F; n=20）、牛血清白蛋白（BSA；n=50）或单独缓冲液（n=50。在某些情况下，微量注射的活细胞在注射部位出现上表面皱褶(图6，G–I). 在缺乏血清的条件下，微量注射后的起皱诱导需要约30–60分钟。

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图6：

模拟2B2肽在体外分解VIF，并在体内诱导褶皱。（A–C）将模拟2B2肽添加到组装1小时的重组人波形蛋白中（A）诱导解聚，解聚在添加（B）后10秒内开始，并迅速进行，以便在5分钟后主要保留ULF-like结构（C）。负染电子显微镜。棒材=100μm。（D–F）为了响应将较高浓度的2B2微量注射到缺乏血清（72小时）的mEF细胞中，VIF经常从整个细胞外围收缩（D，抗波形蛋白免疫荧光；插图，星号表示区域放大倍数较高）。注意在收缩的VIF和细胞表面之间的区域存在波形蛋白颗粒，这显示出广泛的膜皱褶。该细胞在显微注射后60分钟被固定。（E） 在注射低浓度肽并在30–60分钟后固定的细胞中，VIF经常在注射部位附近分解，如Arp2/3染色所示，在注射部位也会形成跛足（E，双标记免疫荧光；vimentin，白色；Arp2/3，洋红；插图，星号附近区域的放大倍数较高）。相比之下，微注射扰乱肽、BSA或缓冲液的对照血清饥饿（72小时）3T3细胞或mEF没有显示其VIF分布的改变，并且没有诱导跛足（注射扰乱肽后活3T3电池中的F、GFP-波形蛋白）。（G-I）偶尔，在注射部位微量注射2B2后，上表面皱褶明显（注射前G，H，活3T3细胞；注射后10分钟）。棒材=10μm。

我们通过微量注射表达活性祖母绿-黄素的3T3细胞，证实了2B2肽对VIF组织和跛足形成的影响，这些细胞已经被血清饥饿72小时（n=35）。如上所述，我们观察到一些反应。一些细胞开始围绕其整个外围起皱，这与整个VIF网络向细胞核的解体和收缩是一致的(图7，A和B). 在其他细胞中，VIF网络的局部分解与局部膜突起一致(图7，C–J). 随后对这些相同的微注射细胞进行的免疫荧光观察证实，这些区域含有平行的肌动蛋白丝，这是板层和板状足的典型特征(图7，H–J).

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图7：

VIF拆卸和膜皱褶的实时成像。（A–B）用2B2肽微量注射一个表达翡翠维生素并保存在2%血清中的活mEF。微注射后，VIF网络解体并从细胞外周退出，这与大多数细胞表面的跛行活动一致（A，翡翠-维生素A和相位对比叠加，之前；B，微注射后10分钟）。（C–J，同一细胞的图像，C–G，活细胞；H–J，固定）带有扩展VIF网络（C，注射前的祖母绿-维生素和相位对比叠加；星号表示注射部位）的活的、缺血清（72小时）3T3细胞中的祖母蓝-维生素。在～30分钟内，VIF网络在微注射部位（E，C中方框所示区域）附近开始解体，VIF解体继续，在注射部位附近形成膜皱褶。这些区域也出现了吱吱声（F、G、波形蛋白；指示时间为显微注射后；D为显微注射60分钟后）。随后对相同的微注射细胞进行固定和染色，证实波形蛋白颗粒也存在于新形成的板层和板状足（H，波形蛋白；I，F-actin；J，相位对比）。所有钢筋=10μm。

我们还研究了2B2肽在2%血清中维持72小时的细胞中的作用。与正常血清中的细胞相比，在这种低水平血清中生长的细胞含有更少和更小的膜皱褶，边缘有许多无皱褶、僵硬的区域。维持在2%血清中的细胞对2B2肽（注射缓冲液中为0.5μg/ml）的反应也更快，微量注射后约10分钟内形成跛足便可证明这一点。这使我们能够长时间监测微注射细胞的行为。在这些实验中，将细胞注射到无皱褶、僵硬区域附近的位置。在36%的细胞（n=22）中，皱褶膜主要在微注射部位附近形成。在某些情况下，运动细胞会反转方向，向新形成的跛足移动(图8，A–H，箭头表示注射位置）。在～45%的微注射细胞中，在整个细胞周围诱导皱褶（例如。，图7B). 剩余的~22%的微注射细胞聚集在一起，其中许多细胞随后重新呼吸并表现出圆周膜褶皱（数据未显示）。其中一些细胞从底物上脱落，这与微量注射其他波形蛋白肽后的细胞行为类似（Goldman等人。,1996).

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图8：

微注射2B2去血清细胞VIF分解后运动改变的实时成像。（A–H，同一细胞的活相对比图像）。用2B2相对的褶皱区域（A，箭头标记微注射部位）微注射维持在2%血清中的移动mEF细胞。在～10分钟（D，15分钟）内，微注射部位附近出现小的膜突起。随着时间的推移，这个跛足细胞变得更加突出，最终这个细胞开始向新形成的跛足细胞的方向移动（A–H，注意A中细胞上方和B中细胞下方的回缩纤维；参见补充视频S4）。棒材=100μm。

IFs作为细胞运动调节中的机械稳定剂

为了支持VIF作为细胞表面的机械稳定剂的作用，已经证明VIF在体外比微管或微丝承受更大的机械应力，并且它们也表现出应变硬化特性，可以拉伸至其长度的～3倍（Janmey等人。,1991; 克雷普拉克等人。,2005,2008). 所有类型的细胞质IF蛋白（Lin等人。,2010). 角蛋白IF蛋白的突变与皮肤起泡性疾病有关，在这种疾病中，角质形成细胞变得脆弱，在轻微的身体压力下容易破裂（Chan等人。,1994). 也已经证明，IF网络的组织结构随着剪切力的变化而迅速变化（Helmke等人。,2000; Sivaramakrishnan公司等人。,2008). 例如，剪切导致角蛋白IF网络的网格大小发生变化，导致其刚度增加，进一步证明IF网络为细胞提供了抵抗外部机械力的机制（Sivaramakrishnan等人。,2008). IF的柔韧性和应变特性可能会局部控制细胞区域的刚度，从而成为跛足的位置和定位的决定因素。

VIF对细胞刚度的局部调节可能有助于解释运动成纤维细胞的行为。在Abercrombie家(1961)他最初描述了运动的成纤维细胞中皱褶膜的特性，发现当细胞表面的其他地方形成新皱褶时，领先的跛足细胞经常停止皱褶，从而导致细胞向不同的方向运动。关于决定跛足足形成位置的因素，目前知之甚少。当然，这涉及到外部刺激（如生长因子）、细胞表面受体、内部信号通路（如Rho和Rac）以及细胞骨架系统及其相关蛋白重组之间的一系列复杂相互作用。根据我们的结果，我们假设VIF的本地组织参与了这些位点的确定。为了支持这一点，我们发现，与含有较多VIF的区域相比，PA-Rac1的激活明显较少，因此含有较少VIF的地区可能会受到干扰。这些结果可能解释了先前的观察，即在PA-Rac1激活后，一些细胞区域需要比其他区域大得多的辐射才能启动跛足症（Wu等人。,2009).

波形蛋白磷酸化与IF组装和组织的调控

在新形成的跛足动物体内，非丝状波形蛋白颗粒富集，这一发现的功能意义尚不清楚。这些结构被证明是短IF（波形符号；Prahlad等人。,1998). 据报道，在上皮细胞的外围区域也有类似的角蛋白IF前体（Windoffer等人。,2006). 虽然波形蛋白颗粒的确切来源尚待确定，但其中至少有一些结构可能是由先前存在的VIF的分解产生的。这种分解可能受蛋白激酶（例如，Lamb等人。,1989)研究表明，磷酸化在调节VIF的组装状态中起着关键作用。例如，Cdk1对波形蛋白非α螺旋N端结构域中Ser-55的磷酸化负责将VIF分解为非丝颗粒，使细胞聚集进入有丝分裂（Chou等人。,1990). 然而，在诱导褶皱过程中磷酸化相关性的确定是复杂的，因为波形蛋白有53个已知和推定的磷酸化位点（Li等人。,2002; 联合体，2010). 其中，19个位点位于N末端，这是一个已知在IF（Chou）聚合中起重要作用的结构域等人。,1991,1996; 赫尔曼等人。,1996). 其中许多位点是参与诱导跛足症和细胞运动的激酶的靶点。其中包括PI3Kγ（Barberis等人。,2009)，韩国α（Sin等人。,1998)，蛋白激酶C（Inagaki等人。,1987)，Raf-1（Janosch）等人。,2000)，蛋白激酶A（Howe，2004)，PAK（转到等人。,2002)和AKT1（朱等人。,2011). 波形蛋白Ser-38是一个特别有趣的位点，因为它被至少7种激酶靶向，包括PAK、PKCε和AKT（Ando等人。,1989; Izawa和Inagaki，2006; 朱等人。,2011). 已知后三种被Rac1或血清添加激活。使用针对波形蛋白pSer-38的抗体，我们发现该位点的磷酸化增加了约350–400%，这与膜皱褶的诱导一致。这伴随着VIF在细胞表面附近的局部分解和沿着剩余VIF的亚基交换速率的增加，如FRAP分析所示。有趣的是，直径为～10-μm的斑点内PA-Rac1的局部光活化仅与照射区域内Ser-38磷酸化的立即增加有关。这种局部磷酸化在不到1分钟的时间内沿着VIF网络在整个细胞内迅速传播。然而，在这些实验条件下，我们只能在PA-Rac1激活的初始位置附近检测到邻近细胞表面的VIF的分解和收缩。

VIF在跛足形成过程中的局部分解可能与波形蛋白磷酸化水平有关。例如，VIF转化为皱褶下方的颗粒和波形可能需要更高水平的磷酸化，而不是诱导VIF网络其余部分的亚单位转换所需的磷酸化。我们添加血清后的FRAP数据表明，情况可能是这样的，因为我们证明在与皱褶膜无关的区域保留的VIF网络中，亚单位交换率增加了两倍。使我们对VIF组装状态调节的理解复杂化的其他因素包括已知与波形蛋白相互作用的大量激酶，调节参与调节VIF动态特性的众多激酶/磷酸酶平衡，以及波形蛋白蛋白链中翻译后修饰残基的数量。也有可能，在一个位点磷酸化之后，其他位点变得更容易访问，因此更有可能被磷酸化。通过这种方式，很可能是多层次的监管促成了波形蛋白的组装状态。为了开始确定特定磷酸化位点的作用，我们对血清添加到表达非磷酸化突变波形蛋白（S38A）网络的无血清波形蛋白细胞的效果进行了初步实验。迄今为止，我们还没有发现与对照组相比，血清添加的总体反应有明显变化（数据未显示）。这一初步结果表明，未来需要利用多个位点的突变进行研究，以确定磷酸化在调节VIF动态特性中的作用，以及在跛足足形成过程中VIF的分解和收缩。

需要注意的是，存在于跛足动物体内的一些颗粒可能代表新合成的蛋白质。支持这种可能性的是细胞前缘存在波形蛋白mRNA（Lawrence和Singer，1986)以及发现波形蛋白颗粒经常与参与“动态共翻译组装”过程的mRNA相关（Chang等人。,2006). 此外，这些非纤维颗粒可能具有不同于完全聚合VIF的功能。例如，研究表明，在轴突再生过程中，新合成的未聚合波形蛋白与活化的MAP激酶、importin-ß和细胞质动力蛋白形成复合物，然后转运到细胞核并随后调节基因表达（Perlson等人。,2005). 在细胞运动过程中，存在于板层/板层区的各种波形蛋白结构也可能参与调节局部粘连。为了支持这一点，波形蛋白与含β3整合素的局灶性复合物（Bhattacharya等人。,2009)β1整合素的调节（Kim等人。,2010)以及帕西林（一种常见于所有局灶性粘连的“衔接蛋白”）的周转率（门德斯等人。,2010). 最后，我们假设这些颗粒的至少一个亚群代表VIF网络集合的一种存储形式，当成纤维细胞向前肢足方向移动时，VIF网络起到机械稳定扩散细胞质的作用。

抗体和药物治疗

使用的抗体为兔多克隆抗波形蛋白314（Helfand等人。,2003)、鸡多克隆抗波形蛋白（Covance，Princeton，NJ）、大鼠单克隆TM38抗波形素pSer-38（Kosako等人。,1999)、兔多克隆抗VASP（Enzo Life Sciences，普利茅斯会议，PA）、兔多clonal anti-rtactin（Millipore，Billerica，MA）和兔多克隆anti-Arp2 p34蛋白（Millibore）。二级抗体包括FITC-、赖氨酸-罗丹明-和Cy5偶联的山羊抗小鼠和抗兔免疫球蛋白G（Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA），以及过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠和抗兔二级抗体（Jackson ImmunoResearch）用于免疫印迹。如前所述进行免疫电子显微镜检查（Helfand等人。,2002). 一些实验中使用了荧光结合的阴茎倍体蛋白（Invitrogen，Carlsbad，CA）。在其他实验中，细胞在暴露于2μM诺卡唑（Sigma）2小时前，血清饥饿72小时，2μM细胞松弛素B（Sigma-）1小时，或0.1μM latrunculin B（Signa）1小时后，再添加血清。

免疫荧光

如前所述，使用甲醇（−20°C）或3.7%甲醛（室温）对细胞进行免疫荧光处理（Prahlad等人。,1998; Yoon公司等人。,1998). 甲醇固定最适合波形蛋白的可视化，而甲醛固定用于保存肌动蛋白结构。为了确定是否存在跛足足，使用指骨肽和抗arp2/3对细胞进行肌动蛋白和肌动蛋白相关蛋白染色。免疫染色制剂使用配备1.4数字孔径（NA）63×和1.4-NA 100×物镜的蔡司共焦LSM510显微镜成像（德国耶拿卡尔蔡司）。

SDS-PAGE和免疫印迹

对于总细胞蛋白的SDS–PAGE，细胞生长在100 mm的培养皿上，达到约70%的汇合度，在添加1 ml Laemmli样品缓冲液之前用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，然后用橡皮警察收集并煮沸5分钟。为了比较可溶性和不溶性波形蛋白的比例，如前所述制备富含IF的细胞骨架（Helfand等人。,2002)血清置换后不同时间免疫印迹分析波形蛋白。细胞计数，然后在含有0.5 M KCl、1%Tx-100、10 mM MgCl的缓冲液中溶解₂磷酸酶抑制剂（1 mg/ml苯甲基磺酰氟；Sigma）和蛋白酶抑制剂（1毫克/毫升TAME[N个_α-(第页-甲苯磺酰基）-我-精氨酸甲酯]，西格玛；在PBS中完全不含EDTA，罗氏，印第安纳波利斯，IN）。然后以1500×g离心10分钟。含有等量细胞裂解液的样品在7.5%或10%聚丙烯酰胺凝胶上分离，并转移到硝化纤维素膜上，然后用辣根过氧化物酶结合二级抗体进行免疫印迹，并使用增强化学发光进行可视化（伊利诺伊州罗克福德的Thermo Scientific；Helfand等人。,2002). 使用柯达分子成像软件v4.0.3量化蛋白质带强度，并使用Microsoft Excel分析数据。

构建和转染

质粒增强型GFP（pEGFP）–波形蛋白（Yoon等人。,1998)，波形蛋白突变体S38A（Eriksson等人。,2004)和显性阴性pEGFP vim_(1–138)（库尔勒等人。,2007)cDNA的制备如前所述。祖母绿维生素由迈克尔·戴维森（佛罗里达州立大学塔拉哈西分校）提供。mCherry-PA-Rac1按照说明制备（Wu等人。,2009). 在一些实验中，通过电穿孔用Emerald波形蛋白和mCherry-PA-Rac1转染细胞，然后在盖玻片上铺板，并在24-72小时内进行免疫荧光处理。在其他实验中，使用FuGene 6（罗氏）转染细胞。在血清饥饿和剥夺实验中，转染细胞在含有0%或2%血清的培养基中孵育前在正常培养基中放置6-12小时。波形蛋白shRNA（T3；GAATGGTACAAGTCCAAGT；门德斯等人。,2010)根据制造商的说明，将加扰序列对照插入pSilencer5.1 H1（Clontech）逆转录病毒载体。简而言之，使用Xfect转染试剂（Clontech）将等量的T3 pSilencer5.1 H1构建物中的shRNA波形蛋白和pCL-Eco辅助质粒（Imgenex，San Diego，CA）共同感染293FT细胞（Invitrogen），即可产生病毒。在感染后第二天收集培养上清液，并在8μg/ml聚brene（Sigma）存在下与目标细胞孵育4-8小时。感染后2天，将细胞置于2μg/ml嘌呤霉素筛选下。波形蛋白沉默的确认通过免疫印迹和免疫荧光完成。

波形蛋白2B2肽抑制IF组装的体外分析

如前所述制备重组人波形蛋白和对应于中心杆状结构域的波形蛋白2B2片段的肽（称为2B2肽）（Strelkov等人。,2002). 简单地说，使用全长cDNA作为PCR扩增的模板，将扩增产物连接到原核表达载体pPEP-T24中，然后在BL21（DE3）中表达该构建物大肠杆菌细胞（EMD Biosciences，加利福尼亚州圣地亚哥）。通过凝血酶裂解从融合产物中分离出2B2肽，按所述进行纯化，并透析到pH 8.4的5 mM Tris-HCl缓冲液中（Strelkov等人。,2002). 通过将重组波形蛋白与肽以1:1至1:10（野生型：2B2）的摩尔比孵育，评估2B2肽对波形蛋白组装成IF的影响。在样品在37°C下培养10 s至1 h（Herrmann）之前，通过添加组装缓冲液（200 mM Tris-HCl[pH7.0]和1.6 M NaCl）来启动VIF的形成等人。,1996). 在其他实验中，在以摩尔比1:≤10添加2B2肽之前，组装VIF 1小时。如前所述，在IF组装或拆卸开始后，每隔70分钟对阴性染色制剂的超微结构分析和比粘度测量进行评估（Herrmann等人。,1993).

微量注射

使用蔡司共焦LSM510或尼康TE-2000倒置显微镜，选择生长在定位器盖玻片（新泽西州维尼兰市贝尔科）上的细胞进行微注射。在某些情况下，细胞在微量注射2B2肽、BSA或搅打肽（Moir等人。,1991)如前所述。在微量注射之前，将2B2或搅乱的肽透析到微量注射缓冲液中（20 mM Tris，pH 7.5，75 mM NaCl中），并进一步稀释至最终浓度0.5–10.0μg/ml（Prahlad等人。,1998). 在注射后5–60分钟内，将微注射细胞固定并进行免疫荧光处理，或使用尼康TE-2000或蔡司LSM 510显微镜进行实时成像（本文稍后详细介绍）。

活细胞成像

使用配备气流阶段培养箱的蔡司LSM 510共焦显微镜在37°C下进行时间推移观察（弗吉尼亚州威廉斯代尔市奈夫特克；尹恩等人。,1998)或尼康Eclipse TE2000-E显微镜，配备完美聚焦系统（尼康，梅尔维尔，纽约州）和INU阶段培养箱系统（日本静冈县Tokai Hit）。在LSM510上以～3–180-s的间隔拍摄活细胞图像，分辨率为512×512像素/英寸，扫描时间为～1s，持续5–60分钟。如前所述执行FRAP（Yoon等人。,2001). 同时拍摄细胞的相控图像，以确保FRAP实验期间细胞形状或位置没有显著变化。使用线扫描功能在488 nm（100%功率，1%衰减）下对条形区域进行漂白，并以1-2分钟的间隔监测荧光恢复，持续时间长达30分钟。对于在尼康显微镜上进行的实验，每隔～30–300秒采集图像，持续时间达12小时。

如其他地方所述，表达PA-Rac1的细胞被保存并准备在黑暗或红光下成像（Wu等人。,2009). 简单地说，在卤素光源和样品之间使用红色滤光片（Schott RG610）获得差分干涉对比度图像，以防止意外的光活化。为了激活PA-Rac1，使用5-mW LSM 510激光模块在458nm处照射细胞。控制照明不应激活PA-Rac1，由同一模块的15-mW、633-nm激光器提供。照明由1-30个脉冲的光组成，使用100%的激光功率。在一些实验中，在PA-Rac1激活后，每隔～10–30秒或每5–10分钟捕捉一次表达翡翠-维酮的3T3细胞的图像，以监测更长时间的细胞。使用1.4-NA 63倍或1.4-NA 100倍物镜拍摄图像。其他实验涉及局部照射直径为～10-μm的斑点后短时间内甲醇固定。在一些实验中，通过将盖玻片暴露在荧光灯下10分钟来完成整个盖玻片的辐照。

细胞运动定量

表达显性阴性波形蛋白（pEGFP-Vim）的mEF细胞的运动率_(1–138))或通过活细胞成像确定对照细胞。MetaMorph v7.0（分子器件，加利福尼亚州桑尼维尔）用于确定细胞运动速率，将细胞核中心作为参考点，并随时间进行跟踪。确定这些点之间的距离，然后除以实时成像的总时间以确定速度。学生的吨通过实验比较细胞的运动特性。结果被认为具有显著性（p<0.05）。

我们感谢Michael Davidson（佛罗里达州立大学塔拉哈西分校）构建的翡翠-维生素，以及Karen Ridge（伊利诺伊州芝加哥西北大学）从vim分离的成纤维细胞^−/−鼠标。感谢Lynne Chang和Satya Khuon对2B2实验的帮助，感谢Anne Goldman、Kyung Hee Myung和Yuan Yuan Wang对技术的帮助。本研究得到了美国国立卫生研究院（向R.D.G.授予GM-036806，向Y.I.W.授予NS-071216，向K.M.G.授予GM-057464）和美国泌尿学会基金会研究学者计划（B.T.H.）的支持。