Beclin 1是早期胚胎发育所必需的自噬基因，是一种单倍体肿瘤抑制因子

摘要

自噬是一种复杂的分解代谢程序，用于蛋白质和其他亚细胞成分的溶酶体降解。当它导致细胞器和其他细胞质物质循环以提供代谢前体时，它通常被激活以响应营养剥夺。酵母菌的遗传分析已经确定了大量自噬所需的基因，并开始将其放入对饥饿作出反应所需的有序途径(1–三). 如果在营养缺乏时不能激活自噬，或在应激时不能激活其组成性激活，则可能导致细胞死亡。因此，自噬有时被称为程序性细胞死亡的第二种形式。自噬和凋亡通常在应激反应中同时激活(4,5). 尽管自噬已被证明在饥饿和许多神经退行性疾病中被激活，但其在正常发育和组织内稳态中的作用尚未确定。

Beclin 1是酵母Apg6/Vps30基因的哺乳动物同源基因。它可以弥补自噬的缺陷apg6酵母菌株，并在哺乳动物细胞中过表达时刺激自噬(6). Beclin 1还可以与凋亡的重要调节因子Bcl-2结合(7). Beclin 1在人类乳腺癌和卵巢癌中单等位基因缺失，在这些肿瘤中表达水平降低(6,8). 在神经系统中，beclin 1存在于与谷氨酸受体δ2（GluRδ2）结合的复合体中，该复合体在lurcher小鼠中的组成性激活导致小脑Purkinje细胞自噬激活和死亡(9). 为了了解beclin 1和自噬在发育和组织稳态中的作用，我们生成并分析了beclin 1^-/-突变小鼠。我们的结果表明，beclin 1对早期胚胎发育至关重要，是一个单倍体抑癌基因，它们表明beclin 2不需要凋亡，但它是自噬所必需的。综上所述，这些结果表明beclin 1和自噬对维持组织内环境稳定至关重要体内他们还表明，调控该途径的其他已知基因突变导致的自噬调控或执行失败可能在人类癌症中起重要作用。

方法

Beclin 1缺陷胚胎干（ES）细胞的产生和Beclin l小鼠的靶向性缺失。4.0-kb生态从含有beclin 1基因的BAC克隆中分离出5′侧翼区域的RI片段和跨越beclin 2基因第二内含子的2.8 kb基因组片段，并用PGK-Neo亚克隆到载体中^第页磁带。将得到的靶向载体电穿孔到ES细胞中。筛选出对G418（100μg/ml）耐药的ES克隆，并将其作为靶向ES克隆^+/-经Southern blot分析鉴定。纯合ES突变克隆是通过在G418浓度升高（2 mg/ml）的培养基中生长杂合ES克隆来选择的。ES克隆的两个独立纯合突变体^-/-通过Southern blot和竞争PCR分析获得并证实。beclin常见的寡聚引物（TGGAGGGCAGTCCATACCCTGG）⁺和beclin^-beclin特异的等位基因和两个引物⁺（GAGCTGGCTCCTGTGAGTATG）或beclin^-在相同的PCR反应中结合了（CGCCTTCTATCGCCTTTGACGAGTTCT）等位基因。ES克隆^+/-注射C57BL/6囊胚获得嵌合小鼠。将传播的杂合子小鼠进行杂交以产生beclin 1^-/-胚胎。用于beclin 1肿瘤的研究^+/-对C57BL/6和129/Ola杂交背景下的动物、窝友进行了分析。通过Southern blot或PCR分析尾部基因组DNA，确定小鼠的基因型。

小鼠胚胎研究。通过定时妊娠来估计胚胎期（产后天数）。对胚胎进行解剖和成像，然后用从胚胎中提取的基因组DNA进行PCR基因分型。活性胚胎的吖啶橙染色如前所述(10). 胚胎组织学检查，用4%多聚甲醛灌注怀孕女性，蜕膜中的胚胎过夜后固定并包埋在石蜡中，并制备8μm连续切片。根据MOM方案（Vector Laboratories），用抗beclin 1单克隆抗体（10μg/ml）对胚胎切片进行免疫染色，然后进行苏木精染色。

类胚体分析。野生型（wt）和beclin 1^-/-ES克隆以相同的细胞密度铺板，并在没有白血病抑制因子（LIF）和饲养细胞的情况下培养，如所述(11). 在第14天收集类胚体（EB），并将其固定在4%多聚甲醛中进行标准组织学检查[苏木精/伊红（H&E）染色]，或固定在2%戊二醛中，然后将其塑料包埋用于半薄（1-μm）切片。一些石蜡切片用无羊膜抗体（1:400）进行免疫染色，并用苏木精进行复染。半薄切片用托鲁定蓝染色并在光学显微镜下成像。

ES细胞凋亡细胞测定。ES细胞在含有10%血清和白血病抑制因子（LIF）的培养基中生长。细胞死亡是通过取血清培养72小时或紫外线照射20 J/m诱导的²然后再培养12小时。碘化丙啶（5μg/ml）染色后，通过荧光激活细胞分选（FACS）定量细胞死亡。

自噬试验的电子显微镜。ES细胞在正常培养基或厄尔平衡盐溶液（EBSS）中的涂胶板上生长2 h。然后对细胞样品进行常规电子显微镜处理，基本上如所述(9). NIH IMAGE软件用于分析自噬空泡的面积（包括AVi和AVd）(12)以及每个部分中细胞的总面积。对25个切片进行了wt或beclin 1检查^-/-ES细胞。

肿瘤组织学检查。在首次出现发病迹象或肿瘤大小可见时进行彻底尸检。根据MOM程序（Vector Laboratories），用抗beclin 1抗体（10μg/ml）对相同肿瘤的切片进行免疫染色。肿瘤组织样本固定在10%的福尔马林缓冲液中，并包埋在石蜡中。根据标准方案制备切片（4-5μm）并用H&E染色。选择有代表性的肿瘤进行免疫组化分析。使用Fisher精确公式进行统计分析t吨用2×2表进行测试。

结果

ES细胞中Beclin 1的靶向缺失。用靶向载体将5′侧翼DNA的外显子1、外显子2和1.6 kb替换为新霉素抗性盒，在ES细胞中灭活小鼠beclin 1基因(图1一). 这导致转录起始位点和翻译起始密码子都被删除。ES细胞中产生了杂合和纯合缺失(图1b条和c（c）). 两个独立的纯合beclin 1^-/-鉴定了ES细胞克隆。Western blot分析证实beclin 1中的beclin-1蛋白减少^+/-ES细胞和beclin 1中完全缺乏beclin^-/-ES细胞，证明靶向等位基因是无效突变(图1d日).

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图1。

胚胎细胞中beclin 1的靶向破坏。(一)beclin 1的基因组结构（仅显示外显子1-4；实心盒）、靶向载体和靶向缺失后的beclin 2等位基因。起始密码子用星号表示。箭头“a”表示wt和目标beclin 1等位基因的通用引物，箭头“b”表示wt等位基因特定引物，而箭头“c”表示目标等位基因特异引物。X、，Xba公司我；H、，Hin公司dIII；R、，生态RI；B、，巴姆你好；新^第页，新霉素耐药盒；胸苷激酶标记物。(b条)用酶消化后beclin 1突变ES克隆的Southern印迹分析Xba公司I.用于区分wt和靶向等位基因的探针如所示一wt等位基因的大小为11kb，突变等位基因为7kb。(c（c）)使用中描述的引物a–c对三种不同基因型的ES细胞（+/+、+/-和-/-）进行竞争性PCR检测一在1.5%琼脂糖凝胶上，wt等位基因（250bp）可以从突变等位基因中分离出来。(d日)使用抗beclin 1抗体对三种不同基因型ES细胞中beclin-1表达的Western blot研究。使用抗RAN抗体控制每条车道的蛋白质负荷。

失去Beclin 1有助于胚胎致死。注射ES产生的嵌合小鼠^+/-克隆入C57BL/6囊胚将突变等位基因传递给F₁然而，beclin 1的杂交后代中没有纯合子突变后代^+/-通过Southern blot或PCR分析，断奶时100只以上幼鼠中的小鼠基因分型，表明beclin 1纯合小鼠在胚胎发育期间死亡(图2一和b条). 胚胎第8.5天从该杂交中分离出的胚胎的基因分型没有发现任何无效突变胚胎，而wt、杂合子和纯合子胚胎的典型孟德尔比率在E7.5时恢复(图2一). 然而，缺乏beclin 1的胚胎表现出严重的发育延迟，E7.5的胚胎尺寸严重缩小就证明了这一点(图2（f）–j个). E6.5时，在wt或杂合胚胎的胚外内脏内胚层（VE）中检测到强beclin 1表达(图2c（c）)和E7.5(图2d日). 尽管在无效突变胚胎中未检测到beclin 1的表达，但很明显，尽管缺乏beclin-1的表达和生长迟缓，胚胎外VE仍可在这些胚胎中形成(图2（f）和克). 尽管没有证据表明前羊膜管闭合，并且羊膜皱襞在无突变胚胎中未能发育，但在无突变胚的胚外和胚胎成分中都能清楚地观察到前羊膜腔(图2小时和j个). 与此年龄段wt胚胎细胞死亡的限制模式相反(9)吖啶橙染色显示beclin 1细胞广泛死亡^-/-E7.5时的胚胎(图2j个).

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图2。

beclin 1的破坏导致早期胚胎死亡。(一)beclin 1子代和胚胎的基因型分布^+/-通过Southern杂交或PCR检测杂交。(b条)杂合子父母所生幼崽断奶时小鼠基因型的Southern blot分析。(c（c）和d日)分别在E6.5和E7.5的wt或杂合子胚胎中beclin 1表达的免疫组织化学分析。切片用苏木精复染。(e（电子）)E7.5时的wt全胚胎图像。c（c）–e（电子）放大倍数相同，标尺为100μm。(（f）和克)用抗beclin 1抗体对同一无效突变胚胎（E7.5）的切片进行免疫染色，并用(（f）)或没有(克)苏木精。(小时)在蔡司Axiovert共焦显微镜和微分干涉对比显微镜下观察零突变（E7.5）的整个胚胎。(我)与中的胚胎相同小时在血清学显微镜下观察。(j个)用吖啶橙染色并在蔡司共聚焦显微镜下用荧光观察无效突变体的整个胚胎。（f）–j个放大倍数相同，标尺为20μm。

在缺乏白血病抑制因子（LIF）的情况下培养的ES细胞和饲养细胞形成的EB用于在体外早期胚胎发育与发育细胞死亡的研究(13,14). 为了进一步了解beclin 1突变的后果，对wt和beclin 1中EB的形成进行了评估^-/-ES细胞培养。由wt ES细胞培养的EB形成空泡或囊性EB，这是EB核心细胞程序性死亡的结果。随着持续生长，囊性EB腔增大并发展为扩张的囊性EB(图3一 左侧) (12). 在培养第14天，对来自wt ES细胞的250个EB进行检查，发现12个扩张的囊性EB（≈5%）。在来自beclin 1的250个EB中未观察到扩张的囊性EB^-/-ES细胞(图3b条 左侧) (P（P）= 0.002). beclin 1的失败^-/-ES培养形成扩张的囊性EB可能是由于EB核心的细胞死亡或细胞清除减少(13). 从两个独立的beclin 1衍生的EB中获得了类似的结果^-/-ES细胞克隆。无羊膜抗血清对EBs的染色(15)发现来自wt和空突变ES细胞的EB可以形成VE，尽管在beclin 1中^-/-EB，这个细胞层由较大的、组织不太好的细胞组成(图3一和b条,赖特). 因此，beclin 1的平均细胞面积^-/-VE细胞（87.75±41.3μm²,n个=150）大约是wt VE细胞的两倍（43.44±10.81μm²,n个= 150). 尽管存在这种差异，但在wt和beclin 1的VEs中观察到VE细胞的典型特征，包括刷状缘微绒毛和空泡的存在^-/-EB。beclin 1在wt胚胎VE中的高表达(图2c（c）和d日)beclin 1引起的VE异常^-/-电子束(图3b条)表明VE缺陷导致beclin 1死亡^-/-胚胎。

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图3。

beclin 1的破坏导致EB VE的异常形成和细胞生长。来自野生型ES细胞的EB分析（第14天）(一)和beclin 1^-/-(b条)如图所示。(一和b、 左侧)石蜡切片的H&E染色。注意wt的扩张囊型和beclin 1的囊空泡型^-/-（比例尺，100μm）(一和b、 右侧)无羊膜抗体免疫染色切片(上部)和toluidene蓝染色，1-μm切片(下部). （比例尺，10μm）

贝克林1^+/-突变小鼠自发性肿瘤发病率高。贝克林1^+/-小鼠发育正常，有生育能力。然而，许多成人beclin 1^+/-随着年龄的增长，小鼠出现了发病迹象，并出现了可见的肿瘤。为了进一步研究这种表型，18至22个月大的beclin 1^+/-处死小鼠及其wt窝友并检查肿瘤。我们发现27例尸检中有16例（≈59%）为beclin 1^+/-小鼠发生肿瘤，而21只（≈14%）体重小鼠中只有3只发生肿瘤(图4一). 其中包括7例B细胞淋巴瘤(图4b条和c（c）)、1个淋巴母细胞淋巴瘤、7个肝细胞癌(图4d日–（f）)和一只同时患上B细胞淋巴瘤和肺腺癌的小鼠(图4克). wt小鼠的肿瘤均为淋巴瘤。因此，beclin 1^+/-老鼠不仅癌症发病率更高(P（P）= 0.001,图4一)也有不同的肿瘤类型。此外，在beclin 1中发现的肿瘤^+/-小鼠比wt小鼠大，表明这些肿瘤可能是在更早的年龄形成的。

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图4。

beclin 1的癌症发病率增加^+/-老鼠。(一)wt和beclin 1的癌症事件和癌症发病率总结^+/-小鼠（年龄和性别匹配）。(b条和c（c）)B细胞淋巴瘤。(b条)肿瘤组织H&E染色。(c（c）)同一肿瘤的免疫组织化学染色b条抗B220抗体（B细胞标记物）。(d日–（f）)肝细胞癌。(d日)含肝细胞癌肝组织的H&E染色。注意上部显示正常组织，下部显示肿瘤。(e（电子）和（f）)正常组织和肿瘤组织在d日.(克)肺腺癌；H&E染色显示肿瘤（左侧）和正常（右侧）肺组织。（比例尺，50μm）

确定beclin 1中是否存在肿瘤^+/-小鼠通过杂合性缺失或基因剂量效应发生，我们分析了beclin1肿瘤组织中beclin1蛋白的表达^+/-老鼠。蛋白质印迹分析(图5一)和免疫组织化学研究(图5b条和c（c）)结果显示，所有检查的肿瘤中均存在beclin 1蛋白。此外，从存在于beclin 1中的六种肿瘤中分离的beclin 1 cDNA的序列分析^+/-小鼠证明他们都编码wt-beclin-1蛋白（数据未显示）。这些研究排除了杂合性丢失（LOH）作为beclin 1肿瘤发生率增加的解释^+/-老鼠。因此，beclin 1的肿瘤发病率增加^+/-小鼠beclin-1基因剂量降低，表明beclin-1是一个单倍体不足的肿瘤抑制基因。

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图5。

beclin 1蛋白在肿瘤中的表达^+/-老鼠。(一)用抗beclin 1抗体或抗Ran抗体（对照）对肿瘤细胞提取物进行Western blot分析。通道1，wt脾细胞裂解物；2-4道，B细胞淋巴瘤；5巷，肺腺癌；车道6，肝细胞癌。(下部)以每条车道的蛋白质水平作为负荷控制。(b条)B细胞淋巴瘤切片(左侧)或没有(赖特)抗beclin 1抗体。(c（c）)肺腺癌切片染色(左侧)或没有(赖特)抗beclin 1抗体。（比例尺，20μm）

贝克林1^-/-突变ES细胞自噬缺陷，但正常凋亡。了解beclin 1中观察到的致死表型的细胞基础^-/-beclin-1突变小鼠与肿瘤发病率增加^+/-小鼠，空白突变ES细胞用于检测凋亡和自噬的潜在缺陷。在紫外光照射下，ES细胞发生p53依赖性凋亡细胞死亡，涉及Bcl-2家族蛋白和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活(16–18). 相反，在取血清时，ES细胞中诱导了第二种形式的程序性细胞死亡，涉及凋亡诱导因子，并且可以与caspase激活解偶联(13). wt-ES细胞和两种独立衍生的beclin细胞之间的细胞死亡无差异^-/-观察到ES细胞系对紫外线或血清剥夺的反应(图6一). 我们的结论是，beclin 1在ES细胞的凋亡中不起重要作用，beclin-1突变小鼠中观察到的表型不是由凋亡细胞死亡缺陷引起的，这与beclin中明显的大量细胞死亡相一致^-/-胚胎(图2j个).

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图6。

beclin 1的破坏导致自噬缺陷。(一)wt或beclin 1的凋亡细胞死亡^-/-紫外线照射或取血清诱导的ES细胞。描述了平均值±SEM(n个= 3). C1和C2表示两个独立的beclin 1^-/-ES克隆。(b条)beclin 1 wt营养剥夺后ES细胞的超微结构检测(左侧)和空突变体(赖特)通过电子显微镜。箭头表示自噬液泡。N、 核心。（比例尺，1μm）

确定beclin 1^-/-ES细胞在饥饿状态下进行正常自噬，在营养剥夺条件下培养2小时，固定、包埋，并在电子显微镜下进行检查(图6b条). 如前所述，wt-ES细胞在饥饿状态下激活自噬，导致大量自噬空泡的形成(12) (图6b条 左侧，箭头）。相比之下，beclin 1^-/-ES细胞在诱导自噬方面表现出明显异常。因此，在beclin 1中，自噬液泡明显减少^-/-ES细胞和形成的液泡较小，似乎不太发达(图6b条 赖特，箭头）。为了量化这一结果，在缺乏营养的wt和beclin 1中，自噬空泡覆盖的区域^-/-测定ES细胞。wt ES细胞自噬空泡的面积分数（≈2.6%）是beclin 1细胞的≈4倍^-/-ES细胞（≈0.6%），表明在缺乏beclin 1的情况下，ES细胞对营养剥夺的自噬反应被强烈消除，这与以前的研究一致，研究表明beclin l可以修复酵母自噬缺陷apg6突变体(6)它能诱导培养的哺乳动物细胞自噬(6,9). 我们得出结论，beclin 1的主要细胞缺陷^-/-突变体破坏了自噬。

讨论

这里的数据表明，beclin 1是自噬、胚胎发生和正常组织稳态所必需的。因此，beclin 1的凋亡反应^-/-ES细胞对紫外线照射和血清提取是正常的，而其对营养剥夺的自噬反应受到严重破坏。我们发现VE提供了一个交换系统，负责发育中胚胎的营养和废物解毒(19)，在beclin 1中异常^-/-胚胎和EB。我们进一步报道，beclin 1突变杂合小鼠的肿瘤发生率很高，这些肿瘤继续从剩余的wt等位基因表达beclin l，从而确定beclin 2是一个单倍体肿瘤抑制基因。

beclin 1作为一个剂量依赖性肿瘤抑制基因的鉴定，以及beclin-1突变的ES细胞能够正常凋亡但自噬严重异常的证明，再加上以往关于人类肿瘤中beclin 1-单等位基因缺失的数据(6)，强烈提示自噬在人类肿瘤抑制中起着重要作用。尽管自噬在肿瘤抑制中的作用之前尚未被证实，但已知人类肿瘤抑制基因与该途径相互作用。例如，PTEN基因的功能丧失突变(21)以及磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）和Akt激酶（Akt）的表达增加(22,23)是人类肿瘤中常见的事件。最近已经证明，PTEN是PI3K/Akt通路的抑制剂，可以促进自噬(24). 此外，结节性硬化症抑癌基因TSC1和TSC2(25)研究表明，雷帕霉素（mTOR）可直接抑制哺乳动物的雷帕霉素靶标，这是一种参与感受细胞内氨基酸库的蛋白质，在细胞大小调节和自噬中起着关键作用(26). 此外，beclin 1最近被鉴定为E2F靶基因(27). E2F是Rb途径的重要组成部分，在大多数人类癌症中被破坏(28). 最后，对二乙基亚硝胺诱导的大鼠肝癌的分析表明，在肿瘤生长过程中，自噬活性降低(20). 这些观察结果，加上本研究中的数据，有力地支持了自噬在调节肿瘤发展中起重要作用的观点体内(6,29)并且它与细胞生长、增殖和死亡密切相关。beclin 1和自噬促进肿瘤抑制的详细机制以及该途径作为癌症化疗新靶点的潜力是值得关注的重要问题。

致谢

笔记

缩写：EB，胚胎体；E类n个，胚胎期n个; ES，胚胎干；H&E、苏木精/曙红；VE，内脏内胚层；wt，野生型。

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