癌症中的微RNA：具有巨大影响的小分子

摘要

简介

1993年首次发现后，由lin-4基因座编码的小RNA与线虫的发育时间有关秀丽隐杆线虫通过调节蛋白lin-14，¹microRNAs经历了长时间的沉默。事实上，花了几年时间才意识到这些小的（19到22个核苷酸[nts]）RNA分子实际上在几种生物体中表达，包括智人，在不同物种中高度保守，对组织和发育阶段具有高度特异性，在发育、增殖、分化、凋亡和应激反应等重要过程的调控中发挥关键作用。在过去几年中，微RNA确实在细胞生物学的复杂电路中占据了位置，揭示了其作为基因表达调节器的关键作用。

MicroRNA基因约占不同物种基因组的1%，每个基因都有数百个不同的保守或非保守靶点：据估计，约30%的基因受至少一个MicroRNA调控。²

MicroRNAs大部分由RNA聚合酶II转录为以发夹结构（pri-MicroRNAs）为特征的长初级转录物，并由RNAse III Drosha加工成70-100 nts长的前microRNA。这些前体分子通过Exportin 5介导的机制输出到细胞质，在细胞质中，由RNAse III Dicer介导的额外步骤产生约22nts的dsRNA，命名为miR/miR*。成熟的单链microRNA产物随后并入称为microRNA-containing核糖核蛋白复合物（miRNP）、miRgonaute或microRNA-containing RNA-induced silencing complex（miRISC）的复合物中，而另一链可能会降解。在这个复合物中，成熟的microRNA能够在转录后水平调节基因表达，大部分通过部分互补与靶mRNA的3′UTR结合，同时导致一定程度的mRNA降解和翻译抑制(图1).

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图1。

microRNAs（miRs）的生物发生、加工和成熟。miR主要由RNA聚合酶II转录为以发夹结构（pri-miRs）为特征的长初级转录物，并在70核苷酸长的前miR中由RNAse III Drosha在细胞核中处理。该前体分子通过Exportin 5输出到细胞质，RNAse III Dicer在细胞质中生成约22个核苷酸的dsRNA，命名为miR/miR*。成熟的miR产物随后被掺入称为miRISC的复合物中，而另一条链可能会被降解。作为该复合物的一部分，成熟miR能够通过靶mRNA的3′UTR的部分同源性调节基因表达结合，并在完全匹配或翻译抑制的情况下导致mRNA降解。RISC，RNA诱导沉默复合物。

我们的实验室参与了一项尝试，以确定染色体13q14处的抑癌基因，该基因与慢性淋巴细胞白血病（CLL）的发病机制有关，CLL是西方世界最常见的人类白血病。约50%的CLL的细胞遗传学研究检测到第13号染色体q14带的缺失，而杂合性缺失研究表明约70%的CLL在第13号q14带存在缺失。然而，通过利用染色体易位和小缺失，我们发现13q14的关键区域不包含蛋白质编码的肿瘤抑制基因，而是包含两个microRNA基因，miR-15a型和miR-16-1型这一结果表明，染色体13q14的缺失导致了这两个microRNA的丢失，首次证明microRNA可能参与人类癌症的发病机制。^三对大量CLL的研究表明miR-15a型和miR-16-1型约69%的CLL。由于这种改变存在于大多数惰性CLL中，我们推测miR-15a和miR-16-1的缺失可能是该疾病惰性形式发病机制中的起始事件或早期事件。^三

在这些初步观察之后，我们立即绘制了所有已知的微小RNA基因的图谱，发现它们中的许多位于基因组中涉及染色体改变的区域，例如在许多不同的人类肿瘤中的缺失或扩增，其中假定的抑癌基因或癌基因分别，经过多年的调查没有被发现。⁴

在这里，我们将展示在人类癌症中，microRNA表达的改变不是孤立的，而是规律。在这些早期研究表明微RNA基因在人类癌症发病机制中的作用后，我们和其他人开发了评估正常和疾病组织中微RNA基因全球表达的平台，并进行了分析研究，以评估人类癌症中微RNA失调。这是一次尝试，以确定microRNA谱分析是否可用于肿瘤分类、诊断和预后。

M（M）微型计算机RNA谱分析在癌症诊断和预后中的应用

对不同细胞类型和组织的剖析表明，microRNAs的表达模式是细胞型和组织特异性的，这表明microRNAs的表达程序是精细的细胞型依赖性，与细胞分化和发育紧密相关。在肿瘤中异常表达的微小RNA列于表1.

白血病/淋巴瘤

CLL公司。

如前所述，人类癌症中microRNA基因改变的第一个证据来自对CLL的研究。在一项关于懒惰与攻击性CLL的大型研究中，Calin等人⁶发现了13个能够区分惰性CLL和侵袭性CLL的microRNA的特征。有趣的是，发现miR-155在不同淋巴瘤中过度表达，包括活化的B细胞样弥漫性大B细胞淋巴瘤，在侵袭性CLL中也上调，而miR-29家族和miR-181的成员被发现表达不足，后来被证明直接调控TCL1癌基因，以CLL的侵袭性形式过度表达。⁵由于对慢性淋巴细胞白血病的治疗采取“等待和观察”的方法，还发现了一种能够区分预后良好和不良的慢性淋巴细胞白血病特征。许多microRNA的测序，包括签名中的microRNA，可以识别microRNA基因的种系和体细胞突变，包括miR-15型,miR-16-1、和miR-29家庭成员。有趣的是，miR-15/16前体的突变也被鉴定出来，影响了pri-miR转化为pre-miR的过程。在两例患者中，白血病细胞中的突变为纯合子，而两例患者的正常细胞中的该异常为杂合子，表明白血病细胞中正常miR-15/16等位基因缺失。⁶因此，miR-15a和miR-16-1的行为与CLL中典型的肿瘤抑制因子相似。有趣的是，Raveche等人³⁶已将新西兰黑小鼠株中负责CLL惰性形式的基因定位在14号染色体上与人类13q14同源的区域。该区域的序列分析显示，新西兰黑小鼠株6 nts 3′的miR-15/16前体突变为miR-16-1（在人类病例中，突变为7 nts 3’至miR-16.1），这也影响了miR-15/10前体的加工。因此，miR-15/16的种系突变可以在人和小鼠中引起慢性淋巴细胞白血病的惰性形式。通过使用不同的算法识别miR-15a和miR-16-1的靶点，发现BCL2级miR-15a和miR-16-1的假定靶点均为保护细胞免受凋亡的癌基因。击倒实验表明情况就是这样。⁷因此，miR-15a和miR-16-1的缺失导致癌基因的高组成水平BCL2级导致了惰性B细胞白血病的发展。滤泡性淋巴瘤是另一种常见的惰性B细胞恶性肿瘤BCL2级由于t（14；18）染色体易位，由于其与免疫球蛋白增强子并列，基因变得不受调控，这表明构成性过表达BCL2级导致惰性B细胞瘤。最近，还发现miR-15a和miR-16-1的缺失虽然间接地导致MCL1公司，另一个癌基因BCL2级凋亡抑制剂家族。³⁷有趣的是，最近一项针对CLL患者的ABT737临床试验，ABT737是一种BCL2级由雅培实验室（伊利诺伊州雅培公园）开发的ABT737显示了白血病细胞对该药物的部分耐药性，因为ABT736对BCL2级但不是为了MCL1公司因此，miR-15a或miR-16-1治疗可消除药物耐药性并提高反应性。体外和体内的其他实验也表明，miR-15a或miR-16-1可以被利用来导致白血病细胞死亡，这表明了基于microRNA的治疗干预的可能性。³⁷

急性髓细胞白血病。

急性髓细胞白血病（AML）是一种异质性疾病，包括多个具有不同遗传异常和临床特征的实体。Garzon等人³⁸报道了AML主要分子和细胞遗传学亚群中独特的microRNA谱。此外，这些microRNA的一个子集与总生存率和无病生存率相关。miR-29家族成员位于两条人类染色体上的两个簇中：miR-29b1/29a位于染色体7q32上，而miR-29b2/c型位于染色体1q23上。重要的是，7q染色体是骨髓增生异常综合征和治疗相关AML中经常缺失的区域。³⁹miR-29家族成员在侵袭性CLL中表达下调，⁶浸润性乳腺癌，¹⁸肺癌，⁴⁰胆管癌。⁸miR-29b转染可诱导胆管癌细胞株的凋亡，并降低裸鼠肺癌细胞的致瘤性。最近，有研究表明，横纹肌肉瘤由于NFkB和YY1水平升高而失去miR-29的表达，并且将miR-29引入肿瘤中会延迟小鼠横纹肌肉瘤的进展。⁴¹MiR-29也被发现直接瞄准MCL1公司,⁸AML中过表达的癌基因，以及新生DNA甲基转移酶DNMT-3A和-3B，尽管是通过调节反式激活子Sp1、维持DNA甲基转移酶DNMT1间接表达的。^40,42因此，miR-29家族成员的缺失导致MCL1公司和的DNMT公司导致AML特征的表观遗传改变。这些最新结果表明，miR-29的缺失可能对主要骨髓增生异常综合征和AML的发病机制至关重要(图2).

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图2。

慢性淋巴细胞白血病（CLL）和急性髓细胞白血病（AML）的分子改变。microRNA（miR）-15a/miR-16-1簇的缺失或下调，位于染色体13q14.3，直接参与BCL2级和MCL1公司表达，代表CLL发病机制中的早期事件。在恶性克隆的进化过程中，其他microRNA（miRs）可能被删除（如miR-29）或过度表达（如miR-155），从而导致B细胞CLL的侵袭性。这种异常会影响其他蛋白编码基因（PCG）的表达，如TCL1公司由miR-29和miR-181直接调控的癌基因，或影响其他非编码RNA（ncRNAs）。这种异常持续累积的后果表现为细胞凋亡的减少以及恶性B细胞存活和增殖的诱导，导致更具攻击性克隆的进化。miR-29家族成员在AML和其他肿瘤类型如肺癌中丢失，也被证明直接靶向MCL1公司和DNMT3A型和B类.

淋巴瘤。

早期研究表明，miR-155在伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤的一个亚组中上调。^9,10这种microRNA由银行识别码（B细胞整合簇）基因，最初被确定为禽白血病病毒诱导的B细胞淋巴瘤中常见的逆转录病毒整合位点。⁴³我们的研究组证明，在B淋巴细胞中过度表达miR-155的小鼠会产生多克隆的白血病前B细胞增殖，随后发生全面的B细胞恶性肿瘤。¹¹最近，两个敲除小鼠模型通过显示miR-155在免疫中的关键作用银行识别码/miR-155−/−具有缺陷的树突状细胞功能、受损的细胞因子分泌和T_H（H）细胞本质上偏向T_H（H）2分化。^44,45此外，miR-155可以代表炎症、免疫和癌症之间的联系，因为其表达可以由炎症介质诱导，并参与对内毒素休克的反应。⁴⁶

He等人¹²据报道，在65%的B细胞淋巴瘤患者中，miR-17-92多顺反子上调，并在小鼠模型中证明该microRNA簇与癌基因协同作用MYC公司加速肿瘤的发展。最近，另一组研究人员发现，淋巴细胞中miR-17-92的过度表达会导致淋巴增生性疾病、自身免疫和过早死亡。¹³转基因淋巴细胞的增殖增强是通过直接调节促凋亡磷酸酶和张力蛋白同源基因介导的(PTEN公司)和比姆。O'Donnell等人¹⁴研究了淋巴瘤中miR-17-92的调节，证明该簇的表达是由癌基因直接激活的c-Myc公司此外，miR-17-92簇及其旁系miR-106b-25，¹⁵用转录因子E2F1建立，E2F1是c-Myc公司负反馈环：E2F1确实代表两个microRNA簇的直接靶点，但它也诱导它们的表达。因此MYC公司同时激活E2F1转录并限制其表达，从而产生严格控制的增殖信号。

多发性骨髓瘤。

最近很少有证据表明微RNA与这种浆细胞恶性肿瘤有关，因为与正常浆细胞相比，miR-335、miR-342-3p和miR-561的异常表达⁴⁷或Stat3介导的致癌miR-21对白细胞介素-6的激活。¹⁶最近，Pichiorri等人¹⁷描述了该肿瘤的microRNA特征。他们通过微阵列分析和实时聚合酶链反应评估了多发性骨髓瘤衍生细胞系CD138中microRNA的表达⁺来自MM或单克隆丙种球蛋白病患者和正常供体的骨髓外周细胞，在异常表达的microRNA中确定致癌miR-21和miR-181。两种miRNAs，miR-19a和19b，miR-17-92簇的一部分，也被证明下调SOCS-1系统，一种在MM中经常沉默的基因，在抑制白细胞介素-6生长信号传导中起关键作用。此外，使用miR-19a和b前体或miR-181a和b拮抗剂处理的人类MM细胞系进行的异种移植研究，在裸鼠体内显著抑制了肿瘤生长，证实了这些微RNA参与MM的发展，并支持将这些分子用作治疗工具的可能想法。

M（M）微型计算机RNA在侵袭、血管生成和转移中的作用

微RNA不仅与原发性肿瘤的发生有关，而且还影响疾病的进展和转移阶段。事实上，一些证据表明，microRNA如何参与调节导致获得转移潜能的生物过程，如粘附、迁移和侵袭以及血管生成。

Ma等人发表了第一批报道微RNA促转移作用的研究之一。²⁴他们观察到，正如之前报道的那样，miR-10b在所有无转移患者的乳腺癌中均下调，¹⁸但令人惊讶的是，50%的转移阳性患者的原发肿瘤中miR-10b水平升高。由转录因子Twist诱导，miR-10b抑制编码同源盒D10（HOXD10）的mRNA的翻译，释放促转移基因的表达RHOC公司从而导致肿瘤细胞的侵袭和转移。

Huang等人通过旨在发现促进体外细胞迁移的微RNA的功能筛选²⁵在使用乳腺癌细胞的肿瘤移植实验中，鉴定了miR-373并验证了其转移潜能。

MiR-34a在多种肿瘤类型中缺失，并参与由著名的“基因组守护者”p53介导的网络，³⁵通过下调遇见在人肝癌细胞中表达。⁶⁹

由于上皮-间充质转化（EMT）被认为可以促进恶性肿瘤的进展，一些研究小组最近研究了microRNA是否参与了这一过程，许多证据支持这一假设。事实上，miR-200家族的microRNAs和miR-205的成员已被证明可以减少针对ZEB转录因子的细胞迁移和侵袭性，ZEB是已知的EMT诱导物，^26,27以及最近在前列腺癌中证实的PKCε。⁷⁰致癌miR-21刺激不同肿瘤类型（包括结直肠癌）的侵袭、外渗和转移⁷¹还有乳腺癌，⁷²而抑癌剂miR-205具有相反的作用，即减少体外侵袭和抑制体内肺转移。²³为了寻找乳腺癌转移的调节因子，Tavazoie等人⁷³确定miR-126和miR-335为转移抑制因子：这两种microRNA水平的降低与乳腺癌患者无转移生存率低有关，而在细胞移植模型中，它们的再表达抑制了转移。

有趣的是，最近有人观察到，来自同一组织的原发肿瘤和转移瘤显示出类似的microRNA表达模式。⁷⁴作为一种比mRNA表达研究更准确的分类器，microRNA图谱揭示了解决癌症诊断中最苛刻问题之一的潜力：未知原发肿瘤转移的起源。

在转移过程中，新生血管生成是使细胞到达并通过全身循环传播的关键步骤。microRNAs也可以在这个水平上控制肿瘤的进展，促进或抑制内皮细胞的增殖。miR-221和miR-222抑制内皮细胞中c-Kit的增殖和血管生成特性，⁷⁵而直接靶向血管内皮生长因子的miR-16、miR-15b、miR-20a和miR-20b的低氧减少支持血管生成过程。⁷⁶另一方面，miR-27b可以通过锌指蛋白ZBTB10的减少和随后Sp转录因子的激活间接增加血管内皮生长因子的水平，⁷⁷miR-126通过抑制芽孢相关蛋白Spred-1和磷酸肌醇3-激酶调节亚单位2。⁷⁸miR-210也可以促进血管生成，miR-210被缺氧激活并直接抑制内皮配体ephrin A3，⁷⁹通过miR-17-92集群MYC公司通过抑制结缔组织生长因子和抗血管生成粘附糖蛋白血小板反应蛋白1，⁸⁰也被miR-27b和let-7f靶向。⁸¹

M（M）微型计算机RNA与表观遗传学

人类癌症中MiRNA的表达可通过多种机制改变(图3)：染色体异常，有证据表明microRNA经常位于与癌症改变有关的基因组区域，⁴最近一项卵巢癌、乳腺癌和黑色素瘤的基因研究证实了这一点⁶⁸; 突变，作为miR-15a和miR-16-1主要转录物中的遗传突变，导致CLL体内外两种microRNA表达减少³⁶; 和多态性（SNP），如肺癌所述。⁸²癌症中microRNA表达被解除的原因也可能是microRNA生物发生机制的缺陷，正如不同肿瘤类型中Drosha或Dicer活性改变导致microRNA水平的变化所支持的那样，^83–86和表观遗传变化，如DNA甲基化的改变。对miRNA基因基因组序列的广泛分析表明，大约一半的miRNA基因与CpG岛相关，表明它们可能受到这种调控机制的影响。⁸⁷一些证据确实证明，甲基化状态的改变可能是导致癌症中microRNA表达失调的原因，因为假定的肿瘤抑制因子microRNA沉默：用DNMT抑制剂5-Aza-2′-脱氧胞苷治疗T24膀胱癌细胞和人成纤维细胞，Saito等人⁸⁸观察到miR-127，即以CpG岛启动子为特征的microRNA强烈上调，能够靶向原癌基因BCL-6型并在几个癌细胞中沉默。采用同样的方法，通过药物治疗揭示表观遗传沉默的microRNA诱导染色质重塑，已经证明miR-9-1在乳腺癌中是高甲基化的，因此下调，⁸⁹以及结肠癌中聚集的miR-34b和miR-34c。⁹⁰

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图3。

microRNA（miR）调节机制。在癌症中观察到的微小RNA表达失调可能是由染色体异常、突变、多态性（SNPs）、转录失调、微小RNA生物发生机制缺陷和表观遗传学变化引起的。

相反，癌症中假定致癌microRNA的上调可能是由于DNA低甲基化，如let-7a-3的肺腺癌所示⁹¹或miR-21的上皮性卵巢癌。⁵⁰

DNMT1和DNMT3b缺失的结直肠癌细胞的microRNA图谱代表了识别表观基因调控的microRNAs的不同方法：与野生型细胞相比，18个microRNA上调，其中只有一个在正常组织中未甲基化，但甲基化，因而沉默，肿瘤中的miR-124a嵌入一个大的CpG岛中，能够靶向细胞周期蛋白D激酶6，后者介导RB抑癌基因的磷酸化。⁹²

甲基化并不是影响microRNA表达的唯一表观遗传机制：Scott等人⁹³结果表明，在SKBR3乳腺癌细胞中，组蛋白去乙酰化酶受到抑制后，microRNA水平发生广泛而快速的变化。

表观遗传学药物的存在，如DNA去甲基化剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂，能够逆转异常的甲基化或乙酰化状态，增加了调节微小RNA水平的有趣可能性，例如，恢复肿瘤抑制微小RNA的表达，从而恢复肿瘤表型。

为了使连接microRNA和表观遗传学的情况复杂化，microRNA本身可以调节表观遗传机制组件的表达，从而创建一种高度受控的反馈机制：miR-29家族直接靶向新生DNA甲基转移酶DNMT-3A和-3B，尽管是间接的，通过调节反式激活子Sp1，维持DNA甲基转移酶DNMT1。有趣的是，将miR-29引入肺癌和AML会导致沉默的肿瘤抑制因子重新激活并抑制肿瘤发生。^40,42Dicer-deficied小鼠胚胎干细胞中miR-290簇的缺失导致DNMT3a、DNMT3b和DNMT1的下调，这是通过上调其阻遏物RBL-2实现的，RBL-2是miR-290的靶点^94,95; miR-1参与肌发生和相关疾病，直接靶向HDAC4。⁹⁶

M（M）微型计算机RNA/A（核糖核酸）抗微生物RNA在癌症治疗中的作用

迄今为止收集的证据表明，microRNAs如何在癌症中代表有效的诊断、预后和预测标记。事实上，microRNA的异常表达与特定的生物病理特征、疾病转归以及不同肿瘤类型对特定治疗的反应相关。

考虑到microRNA在癌症的发展、进展和治疗中的重要性，基于microRNA的治疗在癌症中的潜在用途正在被开发，试图调节其表达，重新引入癌症中丢失的microRNA，或使用抗microRNA寡核苷酸抑制致癌microRNA(图4). 例如，miR-15a/16-1转染诱导白血病MEG01细胞凋亡，并在异种移植模型中抑制体内肿瘤生长，³⁷而反义寡核苷酸对miR-21的抑制在不同的细胞模型中在体外产生促凋亡和抗增殖反应，并在体内降低肿瘤发展和转移潜力。⁹⁷

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图4。

微RNA（miRs）作为治疗工具。通过转染在癌症发展或进展过程中丢失的合成miR而重新引入，或通过使用抗miR寡核苷酸抑制致癌miR，可能有助于抑制肿瘤增殖、延长生存期和获得转移潜能，因此是潜在的治疗工具。

此外，参与特定网络的microRNAs，如凋亡、增殖或受体驱动途径，可能会影响靶向治疗或化疗的反应：抑制miR-21和miR-200b可能通过调节时钟,PTEN公司、和PTPN12号机组,⁹⁸而在乳腺癌细胞中重新引入miR-205可以通过HER-3沉默提高对酪氨酸激酶抑制剂的反应性。²²

正如Slack等人最近报道的那样，除了靶向治疗和化疗外，microRNAs还可以改变对放疗的敏感性⁹⁹：在肺癌细胞中，let-7家族的microRNAs可能通过RAS调节抑制抗肿瘤放射治疗的耐药性。

迄今为止所描述的证据代表了在抗癌治疗中使用microRNA作为靶点和工具的实验基础，但要将这些基础研究进展转化为医学实践，至少有两个主要问题需要解决：开发用于研究癌相关microRNA的工程动物模型，以及提高体内miRNAs/抗microRNAs传递的效率。为此，已开发出半衰期和效率更长的修饰microRNA分子，如抗microRNA寡核苷酸，¹⁰⁰锁定核酸-修饰寡核苷酸，¹⁰¹和胆固醇结合的抗肿瘤药物。¹⁰²有趣的是，Ebert等人¹⁰³最近描述了一种抑制microRNA功能的新方法：合成的mRNA含有特定microRNA的多个结合位点，称为microRNA海绵，能够结合microRNA，防止其与内源性靶点结合。

为了改善微小RNA或抗微小RNA的体内递送，在过去几十年的临床前研究中测试的短干扰RNA（siRNA）或短异源双链RNA（shRNA）的方法¹⁰⁴也可以应用于微RNA。此外，与siRNA/shRNA相比，microRNAs的优势在于它们能够通过一次点击影响多个目标，从而调节整个相互作用分子网络。

总之，15年前，当microRNAs在秀丽C科学界可能甚至没有想到这些小的非编码分子会对我们对细胞生物学和基因调控的理解产生重大影响。

微RNA有助于维持调节细胞命运的基因之间的平衡，而它们的放松调控（不同人类恶性肿瘤的常见特征）可能会破坏这种平衡，从而促进癌症的发展和/或进展，从开始到转移性疾病。然而，尽管越来越多和令人鼓舞的证据表明微小RNA与癌症生物学有关，但许多重要问题仍有待解决；事实上，尽管在过去几年里，微RNA靶点的识别和验证有了很大的改进，但我们对它们所涉及的细胞和分子电路知之甚少。由于microRNA能够靶向多个分子（有时属于相关通路），同时microRNA之间存在冗余，这种情况肯定会变得复杂。这就产生了一个复杂的调控网络，其中特定microRNA的生物效应和特性并不总是允许线性解释。

改进microRNA靶预测的计算程序和验证的实验方法必将有助于阐明其作用机制，转基因小鼠模型可能有助于确定单个microRNA的致癌和抑癌潜力。

迄今为止可用的数据明确支持微RNA参与癌症病因学，并强烈建议将这些分子用作诊断和预后的标记物，最终用作特定治疗的新靶点或工具。从实验室走向临床应用将是癌症研究的下一个巨大挑战。

脚注

参考文献