Pharmacologic- and gene therapeutic-based inhibition of PKCα/β enhances cardiac contractility and attenuates heart failure

Michael Hambleton; Harvey Hahn; Sven T. Pleger; Matthew C. Kuhn; Raisa Klevitsky; Andrew N. Carr; Thomas F. Kimball; Timothy E. Hewett; Gerald W. Dorn, II; Walter J. Koch; Jeffery D. Molkentin

doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.105.592550

循环。作者手稿；可在PMC 2009年7月9日获得。

以最终编辑形式发布为：

循环。2006年8月8日；114（6）：574–582。

2006年7月31日在线发布。数字对象标识：10.1161/循环AHA.105.592550

预防性维修识别码：PMC2707825

NIHMSID公司：美国国立卫生研究院92850

PMID：16880328

基于药物和基因治疗的PKCα/β抑制增强心肌收缩力并减轻心力衰竭

迈克尔·汉布尔顿，文学学士，哈维·哈恩，医学博士，Sven T.Pleger先生，医学博士，马修·库恩，理学学士，莱萨·克莱维茨基，博士，安德鲁·卡尔，博士，托马斯·金贝尔，医学博士，蒂莫西·休特，博士，杰拉尔德·多恩，II，医学博士，沃尔特·科赫、博士和杰弗里·莫尔肯廷，博士

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关联数据

补充资料: 1
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指南：077D18C1-DF57-4238-832A-FAF142DF267C

摘要

背景

传统蛋白激酶C（PKC）亚型α作为钙的近端调节器发挥作用²⁺心肌细胞的处理(Braz等人，2004，Nat.Med.10:248). 删除PKCα小鼠肌浆网钙增加²⁺负载，增强Ca²⁺心脏中PKCα的过度表达减弱了收缩力。PKCα在机械上直接调节Ca²⁺通过改变抑制剂-1的磷酸化状态进行处理，抑制剂-1反过来抑制蛋白磷酸酶-1的活性，从而调节磷蛋白活性，其次是肌浆网钙²⁺ATP酶（SERCA）。

方法和结果

在这里，我们发现Ro-32-0432或Ro-31-8220对传统PKC亚型的急性抑制显著增强了心脏收缩力体内或在一项对野生型小鼠进行心脏准备的孤立工作中，但在PKCα缺陷小鼠。Ro-32-0432还显著增加了两种不同心衰模型的心脏收缩力体内在小鼠心衰模型中使用Ro-31-8220进行急性或慢性治疗肌肉lim蛋白（MLP）基因显著增强心脏收缩力并恢复泵功能。此外，在梗死后心肌病的慢性大鼠模型中，腺病毒介导的显性阴性PKCαcDNA基因治疗挽救了心力衰竭。PKCα也被确定为成人心脏中表达的主要传统PKC亚型，为这些发现与人类病理生理学提供潜在相关性。

结论

PKCα或常规亚型的药理学抑制可能是急性增强心力衰竭某些阶段心脏收缩力的一种新的治疗策略。

关键词：心力衰竭、收缩性、PKC、信号传导、心肌病

介绍

钙蛋白激酶C（PKC）家族²⁺和/或脂质激活的丝氨酸-三氢嘌呤激酶在许多膜相关信号转导途径的下游发挥作用¹PKC家族由大约10种不同的同工酶组成，根据其激活特征进行了广泛分类。传统的PKC同工酶（α、βI、βII和γ）是Ca²⁺-而新的同工酶（ε、θ、η和δ）和非典型同功酶（ζ和λ）是Ca²⁺-独立但被不同的脂质激活²PKCα是主要的钙²⁺-依赖性PKC亚型在小鼠和兔心脏中表达，而PKCβ和PKCγ可检测到，并且可能具有部分重叠功能^三^,⁴.

关于心脏，许多报告表明PKC激活与肥大、扩张型心肌病、缺血性损伤或丝裂原刺激有关¹一些证据也表明PKC同工酶是钙的潜在调节因子²⁺处理和心肌细胞收缩性。例如，在高钙条件下使用佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（PMA）短暂刺激PKC活性²⁺缓冲液导致心肌细胞收缩减少，钙含量降低²⁺短暂的，用PKC抑制剂逆转⁵^,⁶PMA刺激也会降低离体大鼠心脏和/或离体培养细胞的心脏收缩力，PKC抑制剂也会消除这种作用⁷^–¹⁰.

肌细胞收缩和舒张直接受细胞内钙的调节²⁺骑脚踏车兜风。钙²⁺从依赖电压的L型Ca进入²⁺肌膜（质膜）内的通道，诱导大量钙释放²⁺从肌浆网（SR）储存室通过赖氨酸受体¹¹肌细胞松弛是通过钙的隔离来启动的²⁺通过肌浆网钙的活性在SR内²⁺ATP酶（SERCA2）泵和Na⁺/钙²⁺肌膜的交换活性。钙的量值和时间²⁺释放，即收缩强度，是由β-肾上腺素能受体向腺苷酸环化酶发出的信号动态调节的，腺苷酸循环酶产生cAMP，导致蛋白激酶A（PKA）激活¹¹一旦激活，PKA直接磷酸化结钙²⁺调节蛋白，如L型钙²⁺作为调节蛋白磷酸酶1（PP1）的一种手段的通道、ryanodine受体、磷酸λ（PLN）和抑制剂-1¹¹心脏衰竭与钙调节异常有关²⁺处理许多这些蛋白质和β肾上腺素能受体信号的脱敏。

伴随心力衰竭的收缩力丧失也与PKCα蛋白含量和活性的普遍增加有关¹²^–¹⁹我们之前已经证明PKCα作为心脏收缩力和钙的基本调节器发挥作用²⁺肌细胞处理¹⁸^,²⁰例如，PKCα基因缺失小鼠表现为超收缩，而过度表达PKCα的转基因小鼠表现为低收缩。心脏收缩力增强与PKCα基因缺失对压力过载诱导的心力衰竭和扩张型心肌病的保护作用肌肉lim蛋白(MLP公司)小鼠中的基因¹⁸在这里，我们进行了临床前分析，以确定PKCα抑制作为治疗成年小鼠和大鼠心力衰竭的一种手段的疗效。

方法

动物模型

PKCα−/−和MLP−/−之前描述过小鼠¹⁸^,²¹为了保持一致性，所有研究均采用了相同的男女比例。动物实验得到了动物保护和使用委员会的批准。

超声心动图和生理准备

用异氟醚麻醉小鼠，并使用带有15-MHz紧凑型线阵探头的Hewlett-Packard 5500仪器进行超声心动图检查。在M模式下对每只小鼠进行三次超声心动图测量。之前已经详细描述了在小鼠体内进行隔离工作的心脏准备²²在隔离工作心脏制剂中以最终浓度8×10急性输注Ro-32-0432⁻⁸用二甲基亚砜（DMSO）制成的储备溶液，将其与克雷布斯溶液混合，使二甲基亚磺酸盐的工作含量低于0.05%（以0.2–0.4 ml/min的速度注入），并持续5分钟。对于闭胸小鼠的有创血流动力学，通过右颈动脉将1.4F Millar导管置入左心室，以实时监测心率、动脉压和左心室压，以及+dP/dt_最大值)和−dP/dt（dP/dt_最小值)，使用MacLab软件和界面（加州山景城），如前所述²³在该制剂中，多巴酚丁胺以32µg/kg/min给药，而Ro-32-0432以22.5µg/kg/min给药时产生最大反应。

大鼠心衰冷冻治疗模型

之前详细描述了大鼠心衰冷冻梗死模型²⁴简单地说，对成年雄性Sprague-Dawley大鼠（250–300 g）进行麻醉、机械通气，并通过正中胸骨切开术暴露心脏。其中12只小鼠用液氮冷却探针（直径8mm）在左心室前壁进行3次冷冻-解冻循环。其他八只动物接受了假手术。

大鼠插管、侵袭性血流动力学和冠脉内腺病毒给药

体内如前所述，通过冠状动脉内给药途径对大鼠进行心脏腺病毒基因治疗²⁴^,²⁵腺病毒给药4×10¹⁰主动脉交叉夹闭时，快速注射1.6 ml生理盐水中Adβgal（N=12，冷冻梗死组）和AdPKCα-dn（N=7，冷冻脑梗死组）的斑块形成单位。还有一个无病毒假对照组（N=8）。如前所述，使用2F压力传感器（Millar Instruments，德克萨斯州休斯顿）进行心导管插入术，在一周后的闭胸准备中测量整体功能²⁵.

心脏组织学分析

在指定的时间采集心脏，将其固定在含有10%福尔马林的PBS中，并嵌入石蜡中。对每组9µm心脏连续切片进行分析。样品用H&E或Masson三色染色。

原代心肌细胞培养

如前所述，通过酶解1-2天龄Sprague-Dawley大鼠新生儿以及腺病毒感染条件获得心肌细胞的原代培养物²⁶心肌细胞在无血清条件下在补充青霉素/链霉素（100 U/ml）和L-谷氨酰胺（2 mmol/L）的M199培养基中培养。随后用50 nM浓度的Ro-32-0432或Ro-31-8220处理细胞1.5小时。在收获前1小时也给予PMA（200 nM）。

复制缺陷型腺病毒

显性阴性PKCα先前被描述为L368R突变¹⁸^,²⁷AdPKCα-dn或编码β-半乳糖苷酶（Adβgal）的腺病毒在HEK293细胞中进行斑块纯化、扩增、滴度测定，并在CsCl中带状表达，用于上述大鼠冷冻梗死模型的基因治疗。

Western Blot分析

如前所述，使用抗磷蛋白标记物、PKCα、βI、βII、γ和ε（圣克鲁斯）的一级抗体进行蛋白质印迹²⁶^,²⁷重组PKC同工酶标准物的加载量为0.1 ng–15 ng（Upstate Biotechnologies）。使用Vistra ECF试剂（RPN 5785；Amersham Pharmacia Biotech）进行化学荧光检测，并使用磷成像仪进行扫描。

统计分析

两样本Student t检验用于比较两个独立组/样本的平均值，方差分析（ANOVA）用于比较三个或更多独立组的平均值。采用配对t检验比较治疗前后小鼠体内的数值。重复测量方差分析用于分析剂量反应数据。每当进行多次比较时，均采用Newman-Keuls后验。注意，在使用参数测试（如t测试或ANOVA）时需要谨慎，因为这些测试在小样本中并不稳健，如图1C和1D.

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图1

Ro-32-0432和Ro-31-8220在心脏的功能评估

（A）本研究中使用的Ro-32-0432和Ro-31-8220的化学结构。（B） Western blot分析磷酸化MARCKS蛋白，以分析Ro-32-0432（50 nM）和Ro-31-8220（50 nM）与载体（Veh）在感染AdPKCα并经PMA处理的培养乳鼠心肌细胞中的抑制能力。（C）心脏收缩力的独立工作心脏准备（+dP/dt）*P=0.0052或（D）在8×10时输注载体后产生的左心室压力（N=3）或Ro-32-0432（N=4）⁻⁸微克/毫升*P=0.0012。通过两个样本t检验评估统计显著性。

责任声明

所有作者都可以完全访问数据，并对其完整性承担全部责任。

结果

急性输注Ro-32-0432增加小鼠心脏收缩力

失去或抑制PKCα在基线和心力衰竭模型中增强心脏收缩功能¹⁸^,²⁰这些结果表明，一种对PKCα或PKC经典亚型（α、β和γ）具有选择性的无毒、组织可用的药物抑制剂可能具有重要的治疗价值。在这里，我们研究了两种不同的双吲哚基甲酰胺化合物，Ro-32-0432和Ro-31-8220，之前证明它们对经典PKC亚型，特别是PKCα具有选择性和有效性²⁸^–³⁰(图1A). 为了解决这些化合物抑制心肌细胞中PKCα的能力，研究了MARCKS蛋白的磷酸化，因为它被描述为PKC靶点，并且具有特异性结合PKCα同工酶的能力³¹^,³²与PMA刺激后的载体相比，这两种化合物都特异性抑制了心肌细胞中丝氨酸152/156处磷酸化MARCKS蛋白的水平(图1B). 我们无法确定PKCα的任何绝对特异性磷酸化靶点，也无法确定Ro化合物对PKCα细胞内易位的影响（数据未显示）。虽然其他内源性PKC亚型也可以磷酸化MARCKS，但通过过度表达给定的PKC同工酶，该检测变得相对特异(补充图). 使用该试验，Ro-31-8220和Ro-32-0432被确定对PKCα和β最具特异性，但对ε和δ没有特异性(补充图).

为了解决这类化合物在不受神经体液影响的情况下增强内在心脏收缩力的能力，进行了一种分离的工作心脏制剂。平衡后，急性输注Ro-32-0432可显著增强FVB基因背景小鼠心脏的收缩力和左心室压力(图1C、D).

PKCα空白小鼠表现出对收缩力抑制作用的特异性

上述数据表明，Ro-32-0432和Ro-31-8220可以增强心脏收缩功能，尽管这种作用通过传统PKC同工酶抑制介导的相对特异性尚不确定。为了更直接地确定特异性，在野生型或PKCα在一个单独的工作中进行心脏准备的空心。PMA在心脏中作为PKC同工酶的有效激活剂发挥作用，在很大程度上对收缩力产生负面影响⁵^–¹⁰理论上，如果PKCα是上述收缩力数据的主要调节因子，那么PKCα缺乏的小鼠对Ro-32-0432或PMA不应产生反应。输注PMA对浓度为8×10的离体野生型心脏的收缩力没有影响⁻¹¹µg/ml至4×10⁻⁹微克/毫升(图2A). 将PMA浓度提高到8×10以上⁻⁹心脏收缩力严重降低或完全停止(图2A). 然而，PMA在离体心脏中的输注PKCα空白小鼠有明显不同的效果。PMA浓度为8×10⁻¹¹通过4×10⁻⁹产生温和但显著的正性变力作用，即使在最高浓度的PMA下也不会降低PKCα未经治疗的野生型心脏下面的空心脏(图2A).

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图2

PKCα是心脏中调节PKC同工酶的主要收缩性

（A）从野生型（N=4）和PKCα−/−（N=4）小鼠中分离的工作心脏制剂。连续测量收缩率（+dP/dt），以指示的剂量（µg/ml）注入浓度增加的PMA，每次5分钟。使用重复测量方差分析评估这些数据的显著性。所有测量均为+/-扫描电镜。（B）野生型（N=6）和PKCα−/−（N=5）小鼠的分离工作心脏制剂。心脏注射溶媒（N=6）或Ro-32-0432（N=6,8×10⁻⁸微克/毫升）。显著性通过方差分析（P=0.0002）进行评估，然后进行Newman-Keuls后验*与Wt车辆相比，P<0.05。

与上述PMA输注数据一致，Ro-32-0432（8×10⁻⁸µg/ml）并没有显著增强来自PKCα−/−小鼠，而野生型小鼠（C57BL/6背景）的心脏在输注后显著增加（P<0.05）(图2B). 不出所料，来自PKCα−/−小鼠在基线检查或输注溶媒后继续表现出增强的心肌收缩力(图2A、B). 综上所述，这些数据表明，观察到的双吲哚甲酰胺化合物的整体收缩效应主要通过PKCα介导。虽然这些化合物也可以抑制PKCβ和PKCγ，但与PKCα相比，这些亚型在心脏中的总含量显著降低，进一步表明PKCα是一个重要的生物学靶点^三^,⁴与PKCβ、PKCγ和PKCε相比，当按照重组标准归一化为总蛋白含量时，PKCα水平在人类心脏中也占主导地位(图3A、B). 这一结果表明，用双吲哚甲酰胺类化合物对PKCα进行药物抑制也可能对心力衰竭患者具有选择性肌力作用。

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图3

成人心脏PKC同工酶含量的Western blot分析

（A） Western blot panels和（B）人类心脏中指示PKC同工酶的定量按照每个蛋白的重组蛋白标准进行标准化。通过ANOVA（P<0.0001）和Dunnett的后验评估显著性*与βII、βI、γ和ε相比，P<0.01α。

Ro-32-0432增加心力衰竭模型的心脏收缩力

除了增加隔离工作心脏制剂的心脏收缩反应外，麻醉野生型小鼠侵入性制剂中基于导管的Ro-32-0432输注也增加了心脏收缩力(图4A). 在该制剂中，首先用β-肾上腺素能激动剂多巴酚丁胺对小鼠进行激发，以评估肌力作用的最大上限，平衡，然后用Ro-32-0432激发。虽然与Ro-32-0432相关的收缩效应不如多巴酚丁胺强烈，但仍具有显著性（P<0.001）（参见讨论). 由于删除了MLP公司Gαq基因与心脏过度表达(图4B，C). 重要的是，虽然在两种心衰模型中多巴酚丁胺的反应严重减弱，与之前报道的β肾上腺素能受体脱敏相一致，但与野生型小鼠相比，Ro-32-0432的肌力性反应更为持久（P<0.05）。例如，多巴酚丁胺在Gαq小鼠中的激发作用仅为野生型小鼠的16%，而Ro-32-0432输注的剩余变力作用为57%(图4C).

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图4

Ro-32-0432增加Wt和衰竭小鼠的心脏收缩力

（A）在野生型小鼠输注载药（N=5）、多巴酚丁胺（N=5,32µg/kg/min）或Ro-32-0432（N=522.5µg/k/min）后，通过有创性血液动力学对闭胸制剂的收缩性进行评估*与车辆相比，P<0.001。（B）有创血流动力学评估MLP−/−小鼠服用溶媒（N=3）、多巴酚丁胺（N=3,32µg/kg/min）或Ro-32-0432输液（N=3.22.5µg/k/min）*与车辆相比，P<0.001。（C）载体（N=4）、多巴酚丁胺（N=4,32µG/kg/min）或Ro-32-0432输注（N=42,22.5µG/k/min）后Gαq转基因小鼠的侵袭性血流动力学评估*与溶媒输注相比，P<0.001。采用方差分析（ANOVA）评估统计显著性（A、B和C的P<0.0001），然后进行Newman-Keuls后验。

PKCα的药物抑制可恢复心脏功能MLP−/−老鼠

由于传统止痛药的慢性治疗与心力衰竭患者的不良后果有关，我们在这里研究了Ro-31-8220在4-6周内的慢性给药对心力衰竭患者的影响MLP−/−心力衰竭小鼠。在研究开始和6周后，通过超声心动图评估所有小鼠的心室性能。每天注射一次Ro-31-8220（或载体），剂量为6 mg/kg/天，s.q。所有患者均使用Ro-31-H220化合物体内对Ro-32-0432化合物的研究仅仅是因为大规模合成的费用和小鼠长期使用所需的量相关的问题。Ro-31-8220在大鼠体内的药代动力学分析显示，其半衰期为5.7小时，血浆中药物浓度是6小时时PKCαIC50的100倍（参见讨论). 该剂量的Ro-31-8220在小鼠中耐受性良好，在6周内没有明显的有害影响，也没有影响体重。注射溶媒或Ro-31-8220的野生型小鼠在6周内的心室缩短分数或任何其他心室尺寸测量值没有变化(图5A、和表1). 相反，MLP−/−与溶媒治疗或治疗前的基线值相比，Ro-31-8220治疗6周后，小鼠的短缩分数显著降低(图5A,表1). 研究结果如所示图5A在6个月大的野生型中进行MLP−/−小鼠，尽管在老年人中观察到缩短分数的类似改善MLP−/−小鼠（14个月）与经过四周治疗的车用小鼠进行比较(图5B,表1). 通配符和MLP−/−小鼠还接受了隔离的工作心脏制剂，表明心脏收缩力在MLP−/−用Ro-31-8220长期治疗的小鼠，与野生型小鼠相当(表2). 还观察到舒张功能（−dP/dt）和左心室压力的类似恢复(表2).

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图5

Ro-31-8220逆转心室功能丧失MLP−/−老鼠

（A） Wt和MLP−/−载药前超声心动图检查小鼠（N=8MLP−/−，N=8 Wt）或Ro-31-8220（N=10MLP−/−，N=9 Wt）治疗或每天以6 mg/kg/天的速度皮下注射溶媒或Ro-31-8220 6周后*P<0.05MLP−/−与给药后治疗前的Wt小鼠进行比较#P=0.008MLP−/−Ro-31-8220治疗后对MLP−/−Ro-31-8220治疗前，#P=0.0036对MLP−/−车辆治疗前，或#P=0.009 vsMLP−/−车辆处理后。通过配对t检验评估同一组内比较的统计显著性，并通过Ro与载具之间的双样本t检验评估统计显著性。ANOVA用于组间的任何比较（P<0.0001），然后进行Newman-Keuls后验。（B）在对旧Wt（N=8）和MLP−/−溶媒（N=8）或Ro-31-8220治疗（N=9）后的小鼠（14个月，N=8。通过方差分析（P=0.04）评估统计显著性，然后进行Newman-Keuls后验*P<0.05MLP−/−与Wt小鼠进行比较#P<0.05MLP−/−Ro-31-8220之后与MLP−/−车辆处理后。（C）在一项为期3天的单独研究中MLP−/−用载体（N＝6）或Ro-31-8220（N＝6）处理的小鼠#P=0.01百万升−/−Ro-31-8220之后与MLP−/−车辆处理后。通过双样本t检验评估统计显著性。

表1

Wt和Wt患者心脏结构功能的超声心动图评估MLP−/−用载体或Ro-31-8220治疗的小鼠。

		间隔（d）	LVED公司	低压墙（d）	隔板	LVES公司	低压墙	FS（%）
6个月。	预-Veh重量^N=8	0.76+/−0.109	3.82+/−0.244	0.69+/−0.104	1.16+/−0.135	2.59+/−0.197	1.00+/−0.125	35.05+/−0.74
	Ro前的重量^N=9	0.71+/−0.094	4.08+/−0.224	0.69+/−0.093	1.09+/−0.116	2.84+/−0.187	1.00+/−0.044	30.43+/−0.613
	Wt车辆^N=8	0.67+/-0.031	3.95+/−0.051	0.70+/-0.031	1.01+/−0.032	2.54+/−0.051	0.94+/−0.031	35.78+/−0.192
	重量Ro^N=9	0.65+/−0.03	3.94+/−0.06	0.70+/−0.03	0.96+/−0.03	2.66+/−0.07	0.95+/−0.03	32.85+/−0.24

	MLP−/−车辆前^N=8	0.63+/−0.099	4.30+/−0.259	0.61+/−0.097^*	0.86+/−0.116^*	3.52+/−0.234^*	0.76+/−0.109^*	17.92+/−0.529^*
	MLP−/−前-Ro^N=10	0.65+/−0.008	3.98+/−0.199	0.63+/−0.079^*	0.89+/−0.094^*	3.17+/−0.178^*	0.83+/−0.091^*	20.57+/−0.452^*
	MLP−/−车辆^N=8个	0.62+/−0.03	4.37+/-0.07^*	0.57+/−0.03^*	0.77+/−0.03^*	3.35+/−0.07^*	0.80+/−0.04^*	23.31+/−0.23^*
	MLP−/−Ro公司^N=10	0.63+/−.023	4.20+/−0.046	0.64+/−0.028	0.92+/−0.032	2.92+/−0.052^#	0.90+/−0.031	30.34+/-0.232^#

>1年。	Wt车辆	0.81+/−0.05	4.55+/−0.17	0.84+/−0.07	1.23+/−0.09	3.39+/−0.36	1.39+/−0.06	25.87+/−5.10
	重量Ro	0.75+/−0.01	4.31+/−0.35	0.83+/−0.09	1.18+/−0.02	3.05+/−0.33	1.13+/−0.12	29.65+/−2.60
	MLP−/−车辆	0.64+/−0.03	5.01+/-0.15	0.71+/−0.08	0.97+/-0.10	4.24+/−0.26	0.98+/−0.02	15.48+/−3.17^*
	MLP−/−Ro公司	0.80+/−0.03^#	4.64+/−0.41	0.69+/−0.05	1.23+/−0.07	3.24+/−0.42	1.13+/−0.08	30.83+/−2.93^#

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Ro-31-8220逆转心室功能丧失MLP−/−老鼠。（顶部）在赋形剂或Ro-31-8220治疗前或每天以6mg/kg/天s.q注射赋形剂或Ro-31-8220后6周，通过超声心动图评估6个月大小鼠的心脏功能。通过配对t检验评估同一组内比较的统计显著性。方差分析用于四个治疗组之间的比较（P<0.0001），然后进行Newman-Keuls后验。

^*P<0.05MLP−/−与给药后治疗前的Wt小鼠进行比较。

^#P<0.05MLP−/−Ro-31-8220之后与MLP−/−治疗前和治疗后。（下图）在对老年Wt（N=8）和MLP−/−小鼠（14个月，N=8）和溶媒治疗后（N=8，或Ro-31-8220治疗后（N=8）。通过ANOVA评估各组间的统计显著性（P=0.0212），然后进行Newman-Keuls后验。注意，由于设计原因，使用因子WT/MLP和车辆/Ro，带有交互项的双因素方差分析相当于四个独立组的方差分析。

^*P<0.05MLP−/−与Wt小鼠进行比较。

^#P<0.05MLP−/−Ro−31−8220之后MLP−/−车辆处理后。所有测量值均为平均值±扫描电镜（SEM）。以舒张（d）和收缩（s）为单位评估间隔和左心室（LV）壁厚度，单位为毫米（mm）。使用的其他缩写：LVED，左心室舒张末期内径；LVES，左心室收缩末期内径；FS，分数缩短；Ro，Ro-31-8220；车辆、车辆；Wt，野生型。

表2

来自野生型和MLP公司−/−小鼠注射溶媒或Ro-31-8220 4周。

参数	重量	MLP公司−/− 车辆	%更改重量vs MLP	百万像素−/− 罗-31-8220	%更改 MLP-v与MLP-Ro
	N=7	N=7		N=8
心率（bpm）	408 ± 3	404 ± 1	不适用	404 ± 1	不适用
+d日P（P）/d日t吨（毫米汞柱/秒）	6702 ± 202	6133 ± 128	9^*	7099 ± 157	16^†
−天P（P）/d日t吨（毫米汞柱/秒）	4814±107	3189 ± 103	34^*	3962±85	24^†
LVP（毫米汞柱）	126 ± 2	111 ± 3	12^*	132 ± 3	19^†

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所有结果均显示为平均值的标准误差。+/-dP/dt表示基于压力变化导数（mmHg）与时间（sec）的收缩性度量。LVP代表产生的左心室压力。所有的心脏都有节奏（bpm，每分钟心跳次数）。通过方差分析（P=0.002）评估统计显著性，然后进行Newman-Keuls后验。

^*P（P）≤0.05野生型与MLP−/−车辆；

^†P（P）与MLP−/−Ro-31-8220相比，≤0.01 MLP−/−车辆。

虽然Ro-31-8220挽救了心脏收缩性能MLP−/−慢性给药4周或6周以上的小鼠，它没有改变心脏重量，也没有逆转超声心动图评估的心室扩张，也没有改善组织病理学（数据未显示）。这些观察结果表明，与慢性Ro-31-8220治疗相关的心功能增加的一部分可能涉及对收缩力本身的急性影响。事实上，Ro-31-8220注入MLP−/−与溶媒治疗相比，仅3天的小鼠缩短分数改善(图5C).

心脏腺病毒介导显性阴性PKCα基因传递减轻慢性大鼠冷冻损伤模型中的心力衰竭

虽然对传统PKC亚型相对选择性，但本文所用的双吲哚甲酰胺化合物具有抑制其他激酶的潜力。为了进一步研究PKCα作为上述影响的主要决定因素，我们在冷冻介导的梗死损伤12周后，采用显性阴性PKCα腺病毒对大鼠进行基因治疗。在腺病毒介导的对照病毒（Adβgal）或AdPKCα-dn基因转移1周后，通过有创性血流动力学评估大鼠的心室功能。用Adβgal治疗的低温梗死大鼠心脏收缩力显著降低（P<0.05），与我们之前的观察结果一致²⁴而AdPKCα-dn治疗组大鼠的心室功能增强（P<0.05）(图6A). 此外，AdPKCα-dn治疗可在很大程度上逆转代表心力衰竭的左室舒张压升高，但对心率无影响(图6B和数据未显示）。这些数据支持以下结论：成年心脏中PKCα的抑制可增强心脏收缩力，部分缓解心力衰竭。

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图6

显性负性PKCα基因转移逆转大鼠冷梗死模型心力衰竭

（A）在假手术组（N=8）、Adβgal治疗组（N=12）或AdPKCα-dn治疗组大鼠（N=7）中使用闭胸制剂对心脏收缩力（+dP/dt）和（B）左室舒张末压进行有创血液动力学评估。通过方差分析（A组P=0.0014，B组P<0.0001）和Newman-Keuls后验评估统计显著性*与假手术组相比，P<0.05 Adβgal#AdPKCα-dn与Adβgal相比P<0.05。

讨论

与此处提供的数据相关的一个潜在问题是双吲哚甲酰胺化合物Ro-32-0432和Ro-31-8220的特异性。虽然这两种化合物对PKCα都有很好的效力，但每一种都可以抑制其他激酶²⁸^–³⁰特别是另外两种经典的PKC同工酶，PKCβ和PKCγ。然而，考虑到三个经典PKC基因之间的高度序列保守性，PKCβ和PKCγ在调节心脏收缩力方面的功能可能类似于PKCα，因此也可能需要部分或完全抑制这些同工酶。事实上，我们也观察到LY333531号二甲胺类PKCα/β选择性抑制化合物导致野生型大鼠+dP/dt增加28%（数据未显示）。尽管这种化合物被声称是PKCβ特异性的¹³，我们发现对PKCα的抑制活性相对相等（数据未显示）。虽然所有三种常规同工酶都可能调节心脏收缩力，但其他证据表明PKCα可能是最关键的。例如，PKCα是小鼠、兔子和人类心脏中表达的主要传统PKC同工酶，尽管该观察没有考虑到活性的潜在差异（参考文献^三^,⁴和图3). 在缺乏PKCα的小鼠中，Ro-31-0432没有显著增强心肌收缩力，进一步支持了Ro-31-032对心肌收缩力的生物学作用主要是由PKCα引起的这一结论。此外，通过急性输注PMA，心脏中经典和新型PKC同工酶的普遍激活使野生型小鼠的收缩力显著降低，但没有PKCα−/−老鼠。这一结果表明，PKCα是心脏PKC同工酶整体激活后心脏收缩力的主要负调节因子。在大鼠心脏中，PKCα在调节心脏收缩力方面的优势也得到了腺病毒介导的PKCα显性阴性基因治疗的支持。这些结果也与我们之前的观察结果一致，即AdPKCα（野生型）降低了孤立成年心肌细胞的收缩力，而AdPKCβ-dn增强了收缩力¹⁸最后，PKCα−/−如前所述，在基线检查时，小鼠的心脏收缩力继续增加¹⁸.

选择使用的Ro-32-0432和Ro-31-8220的剂量体内超出了计算值在体外IC50值。然而，计算给定化合物的IC50值并没有考虑细胞中的ATP浓度（与双吲哚甲酰胺化合物竞争）、化合物的器官可用性、膜渗透性特征、代谢及其对其他激酶的选择性/结合，所有这些都会影响其有效剂量体内因此，对生物有效性进行实证检验可能比严格遵守任意IC50值更重要。

Ro-32-0432和Ro-31-8220分别增加野生型和MLP−/−无毒性或致死性的小鼠。事实上，27个野生型和MLP−/−给予Ro-31-8220的小鼠在6 mg/kg/天的慢性治疗4或6周期间死亡，也没有观察到任何嗜睡或明显的药物不耐受症状。同样值得关注的是，Ro-31-8220的慢性和急性给药MLP−/−每只小鼠对收缩力都有相同的影响，这表明PKC抑制不会像β-激动剂那样发生明显的脱敏。事实上，在MLP−/−与野生型小鼠相比，Gαq心衰模型显著减弱，但当使用PKCα抑制化合物时，野生型小鼠和两种心衰模型之间的总体收缩力增强基本保持不变。因此，选择性靶向PKCα可能为对β-激动剂脱敏的患者或通常发生脱敏的慢性适应症患者提供独特的治疗方法。

与PKCα抑制相关的一个独特方面是，收缩力仅适度增加，无论是由于基因消融还是双吲哚甲酰亚胺化合物。相比之下，β-激动剂或磷酸二酯酶抑制剂往往对心脏收缩力有更显著的影响，这些影响与心力衰竭患者猝死的发生率增加和更快的失代偿有关³³。虽然在规定肌力支持时，这些数据值得谨慎，但提供这种支持的方式可能存在重大差异。与PKCα抑制相关的心脏收缩力显著增强，但不太强劲，这可能具有更安全的特征。PKCα还调节由β肾上腺素能受体和cAMP启动的一种特殊的效应子集。具体而言，PKCα通过I-1的直接磷酸化发挥作用，导致PP1活性改变，进而调节PLN磷酸化。PLN磷酸化的改变调节心脏中SERCA2的功能，从而控制钙²⁺荷载和Ca的大小²⁺瞬态¹¹.较大Ca²⁺瞬变通过增加肌球蛋白头部和含肌动蛋白的细丝之间产生的跨桥数量，直接增强心肌收缩力，从而产生动力性中风。因此，药物抑制PKCα活性将在SR-Ca水平发挥作用²⁺处理，可能提供更安全的肌力曲线。事实上，小鼠中PLN的缺失只能通过增加SR的负荷来增强心脏收缩力，而不会降低存活率或增加心律失常的倾向³⁴这些观察结果表明，通过PKCα抑制的肌力支持可能比直接激活β肾上腺素能受体或增加cAMP的药物更安全。最后，抑制PKCα也可能有益于不依赖收缩力的衰竭心肌，因为PKCα参与心脏内的反应性信号传导，参与肥厚、负性重塑和失代偿。总之，PKCα代表了一个治疗人类心力衰竭的新靶点，它通过在一个更受限制的生理窗口内调节收缩力，仅通过SR-Ca介导促肌力效应²⁺负载，并可能通过神经内分泌途径减少反应性信号传导。

补充材料

01

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致谢

这项工作得到了国家卫生研究所（SCCOR拨款P01HL077101）和美国心脏协会（J.D.M.）的既定研究员拨款的支持。M.H得到了国家卫生研究院培训拨款T32 HL007752的支持。W.J.K.得到了R01 HL56205的支持，S.T.P得到了美国心脏协会宾夕法尼亚州特拉华附属机构的奖学金支持。我们感谢Jane F.Djung博士的药物动力学分析。

脚注

利益冲突声明：

A.N.C.是宝洁制药公司的员工。与其余作者之间不存在其他重要的财务关系。

工具书类

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