成束因子B在中的关键作用金黄色葡萄球菌人类鼻腔定植

道德许可

研究方案由伊拉斯谟医学伦理委员会批准（MEC 156.137/1996/186）。允许给志愿者接种转基因疫苗金黄色葡萄球菌菌株来自荷兰当局（荷兰基因改造委员会[COGEM]协议BGGO 03/02.13和CGM/040224-04）。

金黄色葡萄球菌菌株

菌株8325-4（野生型）和DU5997（突变型）用于人类志愿者的人工鼻定植。原始8325菌株的基因组序列可在http://www.genome.ou.edu8325–4菌株与8325菌株的不同之处在于不存在三个原噬菌体[22]; 8325–4在平稳相位σ因子（SigB）中存在缺陷[23]. 因此，该毒株不太可能像8325-4野生型毒株（WT）或DU5997（突变毒株）那样定殖并持续存在，从而为人类提供了一种安全的接种方案。DU5997是一个ClfB公司⁻的突变体金黄色葡萄球菌8325–4，无发起人泰克基因（编码低水平四环素耐药性）插入clfB公司基因，如前所述[24]. 对于比较生长实验，我们还使用了金黄色葡萄球菌菌株SH1000是菌株8325–4的衍生物，表达SigB的野生型水平[25].

生长实验

为了反映体内情况，细菌菌株在RPMI 1640（Sigma）中生长，这是一种铁含量有限的最小培养基。菌株也在胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）中培养。用60 ml RPMI或TSB将起始培养物稀释至OD₆₀₀0.1，在37°C下生长，摇晃（200 rpm），在600 nm下用分光光度计监测吸光度32小时（RPMI）或24小时（TSB）。

研究设计：人工接种方案

如前所述，在人工接种前，我们从所有登记的志愿者中获得了两个间隔1周的鼻腔培养物，以区分持续性、间歇性和非携带者（Nouwen等人[26]). 要被归类为持久性携带者，两种鼻腔培养都需要阳性金黄色葡萄球菌。在一种阳性培养物的情况下，志愿者被归类为间歇性携带者。对于非携带者，所有文化都必须是负面的。图1说明了研究的设计。对所有志愿者开始脱色治疗（每天两次鼻用莫匹罗星，持续5天，同时每天用含洗必泰的肥皂清洗一次，持续5 d[Hibiscrub；Regent Medical]）。莫匹罗星和洗必泰治疗5周后，再次培养鼻孔以评估定植状态，并进行实验性鼻腔接种。

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图1

研究设计

首先，将左鼻孔或右鼻孔随机分为两组，分别接种8325-4株（WT）和DU5997株（突变株）。其次，对侧鼻孔随机接受自然发生（图中为“WT”）或突变株。

两种接种菌株8325-4和DU5997(ClfB公司⁻)在TSB中分别培养至对数期。接种前立即制备混合物。在一个鼻孔内，2×10⁷以1:1的比例使用8325–4/DU5997混合物的cfu，而在对侧鼻孔使用1×10⁷安装了8325–4或DU5997的cfu。志愿者的鼻孔随机分配如下：首先，通过画一个密封的信封，随机分配左鼻孔或右鼻孔接受接种混合物。其次，画出另一个信封，说明应在对侧鼻孔接种哪种单一菌株（8325-4或DU5997）。因此，所有16名受试者的一个鼻孔接种了混合培养物，一半受试者在对侧鼻接种了8325-4，另一半接种了DU5997。随机分组按运输状态分层。

这种设计允许根据两种不同的接种方案评估两种菌株的存活率。接种是以盲法进行的，以防止在阅读鼻腔培养物的生长结果时产生偏见。接种后第1、2、3、4、7、14、21和28天进行后续培养(图1).

SDS-PAGE、免疫印迹和酶谱分析

金黄色葡萄球菌细胞悬浮在OD₆₀₀在30%棉子糖和20 mM氯化镁中加入40₂最终体积为100μl。向每个样品中添加12-μl溶葡萄球菌素（2 mg/ml）和8-μl蛋白酶抑制剂（全鸡尾酒；Boehringer Mannheim），并在37°C下培养悬浮液20分钟。在12000℃下离心去除原生质体克将含有壁相关蛋白的上清液在等体积的最终样品缓冲液（0.125 M Tris-HCl[pH6.8]、4%[w/v]SDS、20%[v/v]甘油、10%[v/v]β-巯基乙醇和0.002%[w/v]溴酚蓝）中煮5分钟。采用标准方法进行SDS-PAGE分析。蛋白质通过湿式系统（Bio-Rad）电泳转移到PVDF蛋白质印迹膜（Boehringer Mannheim）。将膜在4°C的温度下在10%的封闭试剂（漫威奶粉）中培养过夜。主要抗ClfB A区抗体以1:5000的稀释度在室温下培养1小时。通过在室温下孵育1小时，使用蛋白A缀合的辣根过氧化物酶（Sigma，1 mg/ml的原液，稀释为1:500）来检测结合的抗体。根据制造商的说明，使用LumiGLO化学发光底物（新英格兰生物实验室）开发膜，并暴露于X射线胶片。

细菌细胞对固定化重组人细胞角蛋白10的粘附

遵守金黄色葡萄球菌固定化重组人细胞角蛋白10（rMK10）的方法如下。在碳酸盐缓冲液（15 mM Na）中用rMK10涂覆Nunc-Imumuno MaxiSorb微量板₂一氧化碳_三，35 mM NaHCO_三[pH9.6]）并在4°C下培养过夜。添加牛血清白蛋白（5 mg/ml），并在37°C下培养平板2 h。用PBS将平板清洗三次。细菌细胞悬浮液（OD₆₀₀添加（100μl/孔），并在37°C下培养平板1.5小时。用PBS清洗板三次；将结合细胞用甲醛（25%v/v）固定30 min，然后用结晶紫（0.5%v/v，100μl/孔）染色1 min。用PBS洗涤三次后，添加乙酸（5%v/v。在570 nm处用ELISA平板读取器（Labsystems Multiskan Plus）测量吸光度。

微生物程序

用无菌棉签（Tran棉签；医用电线和设备）分别从每个鼻孔获取鼻腔样本。在斯图亚特的培养基中通过剧烈旋涡立即处理拭子。根据之前发布的定量携带评估协议，将该培养基稀释液接种在苯酚红甘露醇盐琼脂（PHMA）和苯酚红甘露醇盐肉汤（PHMB）中[18,26]. 接种后的所有阳性培养物金黄色葡萄球菌通过在含有和不含四环素的培养基上电镀来筛选四环素耐药性，以评估是否存在四环素耐药金黄色葡萄球菌参与者内源性鼻菌群中的菌株。DU5997金黄色葡萄球菌该菌株具有低水平的四环素耐药性（最低抑菌浓度：2μg/ml）。阅读琼脂平板的技术人员不知道志愿者接种了什么菌株（盲法评估）。

细菌基因分型

四环素耐药性的检测是通过圆盘扩散法进行的。利用横跨四环素抗性盒插入位点的特异性引物，通过PCR验证耐药性。此外，通过脉冲场凝胶电泳（PFGE）（CHEF Mapper；Biorad）对每个培养物中的两个随机分离物（对四环素耐药或敏感）进行基因分型。在25°C的SuRe-cut缓冲液中，使用20 U SmaI（Roche Molecular Diagnostics）在4小时内消化塞内的DNA。使用0.5×TBE缓冲液（Biorad）在6 V/cm和14°C下进行电泳。该程序由两个区块组成：60°/−60°角度下10小时，切换时间为5–15秒，然后是60°/‐60°角下10小时和15–45秒的切换时间。如果菌株的PFGE指纹差异不超过三个谱带，则认为菌株具有克隆相关性[27].

抗-ClfB ELISA

ELISA的血清工作体积为100μl。每一步后，用含有0.1%v/v Tween 20的磷酸盐缓冲盐水（PBS；pH 7.4）清洗微孔板三次。用重组ClfB在50 mM碳酸钠（pH 9.5）中在4°C下涂敷过夜。用5%（w/v）牛血清白蛋白在37°C的PBS中封闭2h，并用PBS洗涤三次。然后涂抹志愿者的血清，并在室温下摇晃培养1h。然后将与兔抗人抗体（Dako）结合的稀释（1:10000）辣根过氧化物酶添加到微孔中，并在室温下持续培养1 h。通过添加四甲基联苯胺来发展反应，并通过添加H来停止反应₂SO公司₄在ELISA平板读取器（Bio-Rad）中在450nm处测量反应。

样本大小计算

早期的接种研究表明，在人工接种后，超过一半的接种者在随访1个月时仍携带接种菌株[18]. 我们估计，在随访结束时，8325-4株仍存在于50%的接种志愿者中，而DU5997株仍存在10%。在95%的置信水平和80%的功效下，我们需要在至少15名健康志愿者中接种8325-4株和DU5997株。

DU5997菌株与8325-4菌株具有相同的适应性

我们将菌株8325–4的生长与SH1000（具有全功能SigB）和DU5997（在ClfB中有缺陷）进行了比较。生长是在反映体内生长条件的介质中进行的。结果表明，与TSB相比，RPMI中细菌的生长速度较慢，在固定相的光密度要低得多。8325–4的倍增时间在RPMI为108分钟，在TSB为40分钟。在RPMI中，8325–4和DU5997的生长速度和产量无法区分，而SH1000的生长速度稍快（加倍时间96分钟），密度更高(图2A） ●●●●。

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图2

ClfB表达实验

（A） RPMI中的细菌生长和ClfB表达。菌株8325–4、DU5997和SH1000在RPMI中生长，并定期取样监测生长。

（B） 在生长的早期指数期、早期稳定期和晚期稳定期采集的样本通过Western免疫印迹法进行分析。通道1、2和3分别在指数生长早期、稳定生长早期和稳定生长晚期显示菌株8325-4的ClfB表达。通道4、5和6分别在指数生长早期、稳定生长早期和稳定生长晚期显示菌株DU5997的ClfB表达。泳道7、8和9分别显示SH1000在早期指数生长期、早期稳定生长期和晚期稳定生长期的ClfB表达。

（C） TSB中的细菌生长和ClfB表达。菌株8325–4在TSB中生长，并定期取样以监测生长。

（D） 采用免疫印迹法检测生长早期指数期、早期稳定期和晚期稳定期的ClfB表达。通道1、通道2和通道3显示了在TSB中生长的菌株8325-4在指数生长早期、稳定生长早期和稳定生长晚期的ClfB表达。

ClfB表达依赖性粘附细胞角蛋白10

比较RPMI和TSB培养细菌对ClfB的表达。此前，研究表明，在富培养基中生长的静止期，8325–4细胞上无法检测到ClfB蛋白，这一点在这里得到了证实(图2B）[28]. 相反，在所有生长阶段（包括后期稳定期），RPMI-冠SH1000和8325-4中的完整ClfB水平相同(图2B） ●●●●。

培养至中指数期的细菌细胞对固定化CK10的粘附能力进行了测试(图3). 尽管一些ClfB分子降解为缺乏结构域N1的非功能形式，但TSB中生长的菌株8325-4与CK10的粘附性比RPMI中生长的8325-4更强[28]. ClfB表达完全缺陷的DU5997粘附性较差，表明RPMI-生长细菌对CK10的粘附依赖于ClfB的存在。

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图3

金黄色葡萄球菌重组细胞角蛋白10在不同生长阶段的粘附性

数据代表三个独立的实验。条形图代表标准偏差。

（A） 指数生长期细菌细胞对rMK10的粘附。菌株8325–4在RPMI或TSB中生长到指数阶段，其结合rMK10的能力与在RPMI中生长的DU5997进行了比较。

（B） 生长静止期细菌细胞对rMK10的粘附。将菌株8325–4在RPMI或TSB中生长到固定相，并将其结合rMK10的能力与在RPMI中生长的DU5997进行比较。

与指数期细胞相比，在TSB中生长到固定相的8325–4细胞在粘附方面存在缺陷(图3)，这与中显示的缺少ClfB一致图2D.在RPMI中生长到固定相的菌株8325-4与CK10的粘附性比指数期的同等数量的细胞更强烈，而DU5997的粘附性较差。

菌株8325–4停留在鼻子里，DU5997没有

接种8325–4和DU5997后ClfB公司⁻细胞，大多数志愿者（14/16）在第4天后没有携带DU5997菌株，而在此阶段后缺少8325-4菌株的志愿者较少（7/16）。2周后，所有志愿者均消除了DU5997菌株，而在随访结束后28天，三名志愿者仍存在8325-4菌株。在接种前筛查期间，发现这三名志愿者是持续性或间歇性鼻腔携带者。

8325–4菌株的总体中位生存时间显著高于DU5997菌株：中位7.0（95%可信区间[CI]，±4 d；四分位区间：2–21 d），而3（95%可信范围，±1 d；四元区间：2-4 d；对数秩：第页= 0.006;图4A） ●●●●。活菌计数金黄色葡萄球菌接种后8325–4菌株始终较高(图4C） ，但不显著。接种金黄色葡萄球菌间歇性携带者的细胞培养平均随访时间（18.3±12.1 d）比持续性携带者（7.0±8.6 d）或非携带者培养的细胞平均随访时间更长（5.4±6.3 d）；单向方差分析：第页= 0.025). 随访期间，所有志愿者均未使用抗生素。接种菌株的鉴定通过四环素敏感性测试、PFGE和对clfB公司轨迹。

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图4

野生型菌株与突变菌株在鼻内的存活率

（A） 8325–4的Kaplan-Meier生存曲线金黄色葡萄球菌（实线）及其ClfB公司⁻人类鼻子中的突变株（DU5997）（虚线）（两个鼻孔中最后培养的菌株）。突变株的所有细胞在14天后被清除，这明显快于8325-4的清除率金黄色葡萄球菌应变。

（B） 8325–4的Kaplan-Meier生存曲线金黄色葡萄球菌（重量）和ClfB公司⁻将突变株（DU5997；虚线）混合接种在一个鼻孔中。

（C） 随访样本中的cfu数为8325–4和DU5997。

分析混合疫苗接种鼻孔内的存活率也表明，8325-4菌株的存活时间明显更长：中位数为4.0（95%置信区间，±1天；四分位间距：2-7天），而3.0（95%置信区间，±1天；四分位间距：1-3天；对数秩：第页= 0.033;图4B） ●●●●。比较8个鼻孔中单独接种的8325-4菌株与其他8名志愿者接种的DU5997菌株的存活率，也显示8325-4的存活率更长，但这没有达到统计学意义（未公布的数据）。在本实验中，我们还评估了菌株是否越过对侧鼻孔，而不考虑细菌负荷和菌株移位。在两种情况下，DU5997菌株从混合物中交叉到对侧鼻孔，其中只接种了8325–4株菌株（仅在人工接种后的第一天）。6名志愿者将混合液中的8325–4菌株交叉到对侧鼻孔，在那里只接种DU5997，从随访的第1天到第28天发生。

我们要感谢Nicole Lemmens，她用定量mRNA PCR技术进行了优雅的ClfB表达分析实验，但她的数据最终没有用于本手稿的最终版本。Heiman F.L.Wertheim和Alex van Belkum都可以完全访问数据，并对数据的完整性和数据分析的准确性承担全部责任。