人Nfu（一种铁硫化合物）的亚细胞分区簇状支架蛋白及其组装[4Fe–4S]的能力群集

摘要

铁硫蛋白广泛分布于许多生物体中在电子传递、代谢反应、，以及转录调控(1). 酶参与Fe–S簇合物首次在尼弗炉（固氮）操纵子棕色固氮菌(2). 遗传和生物化学研究表明，两种基因产物NifS和NifU对固氮酶中铁硫团簇的组装(三–6).随后对多种原核生物的研究导致了识别国际标准委员会（铁-硫簇组件）操纵子(7,8)，它对翻译调节剂IscR(9)，半胱氨酸脱硫酶IscS(7)，支架蛋白IscU(10)和IscA(11,12)，伴侣蛋白HscA和HscB(13)和铁氧还蛋白Fdx。IscS是一种半胱氨酸脱硫酶，可产生丙氨酸和元素通过在半胱氨酸上形成过硫化物中间体来制备硫残渣(4,14). 硫被转移直接作用于支架蛋白IscU(15,16)对于序列[2Fe–2S]组件²⁺和[4Fe–4S]²⁺集群(17). 已经提出了IscU中的瞬态Fe-S团簇随后被输送至特异性靶蛋白(17).

除了IscU蛋白，最近的遗传和生化研究(18)建议其他Nfu等蛋白质也参与Fe-S的生物合成集群。葡萄球菌NifU由三个不同的域组成：N端IscU样结构域、中心Fdx样结构域和C端类Nfu结构域(19,20). 突变体答：。棕色固氮菌保守半胱氨酸残基发生取代的菌株在NifU的IscU-like和Fdx-like结构域中，缺陷的严重程度低于Δ尼福尼亚大学应变，表明Nfu-like结构域具有Fe-S团簇组装中的重要作用(20). 同样，酵母菌株缺乏Nfu1p的人表现出铁-S蛋白活性的丧失，支持了的角色非功能单元1在Fe–S簇组件中(21,22). 此外，酵母非功能单元1在一个合成致命屏幕上被识别第1季度销售季度,参与Fe-S生物生成的酵母线粒体伴侣基因集群(22). 这个蓝藻聚胞菌PCC6803包含单个Nfu样基因(syNifU公司)但没有IscU-like基因(23).SyNifU公司是一个基本基因聚回声囊炎，表明Nfu样蛋白在缺乏IscU样蛋白的情况下，可能作为Fe–S支架蛋白(18). 为了支持这一点假设，西雄和中井(24)报告转让a[2Fe–2S]²⁺SyNifU的集群（a聚回声囊炎Nfu同源物）到聚回声囊炎铁氧还蛋白恢复铁氧还苷的电子转移活性。

在本文中，我们报道了人类Nfu的特征。人类恩夫该同源物名为HIRIP5，首次在双杂交筛选中被鉴定为与转录调节器HIRA相互作用的蛋白质(25). 然而，在这个文章，5′RACE和PCR扩增实验显示人类完整cDNA中的5′序列核燃料元件.分析cDNA序列和蛋白质表明选择性剪接导致产生两种靶向不同的人类Nfu亚型哺乳动物细胞中的亚细胞隔室。此外，生物化学研究穆斯堡尔谱学实验表明，人类Nfu可以结合不稳定[4Fe–4S]²⁺可能扮演在Fe-S团簇组装中发挥重要作用。

材料和方法

人Nfu同源基因的克隆和序列分析。克隆包含类似于酵母的序列非功能单元1从人类EST数据库（编号：BG 718178和NM 015700），并进行了进一步分析通过测序。使用组合进行5′RACE实验人类心脏和肝脏马拉松免疫cDNA（CLONTECH）。5英尺赛道将产物克隆到Bluescript载体pSK+（Stratagene）中并测序。通过与从Celera数据库获得的基因组序列。GST融合构造通过PCR克隆Nfu亚型I和II的编码序列制备（请参见图1)转化为pGEX-4T-1（阿默舍姆制药公司）。这些序列也被克隆到pcDNA3.1（+）中（Invitrogen）用于在体外翻译与瞬时转染实验。

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图1。

替代拼接核燃料元件前mRNA产生两种亚型不同的翻译起始点。(A类)预测的序列两种人类Nfu亚型。方框区域表示编码序列。请注意HIRIP5公司先前报告于8月3日开始。这个星号表示火焰中的终止密码子仅存在于亚型II中成绩单。(B类)替代品使用机制示意图基因外显子I的5′剪接位点核燃料元件生成两种亚型不同的翻译起始位点（AUG1或AUG2）。(C)凝胶用两种方法获得的RT-PCR DNA片段的电泳分析不同的底漆组。箭头表示从亚型I扩增的片段，星号表示从亚型II扩增的片段。

防抱死制动系统。一种合成的多重抗原肽（MAP），对应于人类Nfu亚型I的239–253氨基酸由生物合成（德克萨斯州路易斯维尔），用于生成兔子多克隆α-Nfu（MAP）4337（弗吉尼亚州维也纳Covance实验室）。兔多克隆抗体4333由Covance Laboratories针对纯化的Nfu蛋白产生通过使用GST–Nfu亚型II构造生成。纯化了抗体蛋白质A Sepharose 4B柱（Amersham Pharmacia）或特定MAP肽亲和柱。描述了针对人类IscS和IscU的抗体(26,27). 这些中使用的其他Abs研究如下：小鼠单克隆α-Oct-1（钙生物化学）和绵羊多克隆α-锰超氧化物歧化酶（α-Mn-SOD）（Calbiochem）。

细胞裂解物和亚细胞级分。为了获得Triton®声波风廓线仪裂解物，人横纹肌肉瘤（RD4）细胞在4℃用PBS洗涤并溶解在1%Triton X-100裂解缓冲液中(26). 获得亚细胞将部分细胞颗粒悬浮在洋地黄素裂解缓冲液中（0.08%洋地黄素/210 mM甘露醇/70 mM蔗糖/完整蛋白酶抑制剂混合物（罗氏分子生物化学）/4 mM Hepes，pH 7.2），并培养104°C时最小值。洋地黄素裂解物在600×克在4°C下保持10分钟，并将其分离为可溶性和不可溶性部分。清洗含有细胞核的不溶性部分，然后用NER试剂（皮尔斯）。提取后，样品在16000℃下离心×克持续10分钟，上清液构成核分数。洋地黄素裂解的可溶性部分在7,000 ×克在4°C下保持9分钟，并分离为细胞溶质（上清液）和线粒体部分（颗粒）。这个线粒体部分用Triton X-100裂解缓冲液进行裂解。

免疫荧光、免疫沉淀和Western Blot分析。RD4和COS-7细胞（美国型培养物收集）在DMEM中用10%未来作战系统。使用FuGENE6转染进行转染试剂（罗氏分子生物化学），并在48小时后进行分析转染。体外转录和翻译反应是使用TNT耦合网织红细胞裂解物系统（Promega）进行。

将转染的COS-7细胞固定在4%甲醛中20分钟，甲醇渗透2min，α-Nfu 4333染色，其次是荧光素结合的驴抗体与兔IgG。这些样品是使用蔡司LSM510激光扫描共焦显微镜进行分析。免疫沉淀和Western blot分析使用描述的程序(27).脉冲追踪实验首先通过培养细胞进行在37°C的无蛋氨酸DMEM（耗尽介质）中保持30分钟，然后补充2 mCi/ml（1 Ci=37 GBq）的耗尽介质中的脉冲标记[³⁵S] 蛋氨酸（ICN）。标记后，将细胞在PBS在4°C下加入5 mM蛋氨酸，然后在培养基中培养（DMEM和5 mM蛋氨酸）在37°C下进行不同的追逐间隔。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分析免疫沉淀物，然后放射自显影或荧光成像仪（分子动力学）分析。

人Nfu蛋白体外铁硫簇组装。 大肠杆菌用B-PER裂解表达BL21（DE3）的GST-NfuN下厌氧手套箱中的试剂（皮尔斯）₂大气。通过添加0.25 mM启动群集重建⁵⁷富铁（95%加上富集）氯化铁反应含有细胞裂解物、2 mM硫化钠、2 mC半胱氨酸和5 mM的混合物二硫代三醇。3小时后，从反应中分离出GST-Nfu蛋白使用谷胱甘肽Sepharose 4B（Amersham Pharmacia）制成的混合物。Nfu是用凝血酶从GST标签上切下，并使用HiTra Q Sepharose柱（Amersham Pharmacia）。含有纯化成分的馏分合并Nfu（根据紫外可见光谱和SDS/PAGE判断）浓缩在配备YM-10膜的Amicon diaflow超滤器中（密理博）。纯化的Nfu蛋白的浓度由BCA蛋白分析（Pierce），并使用Nfu的分子量=26 kDa单体。通过提取铁与2MHCl在95°C下放置20分钟，使用抗坏血酸存在下的铁锌测定(28).

光谱测量。紫外可见吸收光谱为记录在Beckman DU640分光光度计上。穆斯堡尔谱为记录在配备Janis Research的弱场光谱仪中（马萨诸塞州威明顿）8DT变温低温恒温器或强磁场配有Janis CNDT/SC SuperVaritemp低温恒温器的光谱仪8-T超导磁体。两个光谱仪都在恒定的条件下工作变速器几何中的加速模式。光谱的零速度指金属铁室温光谱的质心箔。

结果

人Nfu同源基因的克隆。DNA数据库的初步搜索酵母Nfu1p的人类同源物鉴定为HIRIP5（GenBank登录号NM015700），与Nfu1p具有39%的序列一致性(25). 然而，进一步分析发现≈20种人类EST与HIRIP5相同，但在5′区存在两种显著差异。首先这些EST中没有从HIRIP5的5′区插入90nt。其次，这些EST中至少有五个扩展了5′序列，包括上游帧内ATG。因此，这些结果表明有两种人类细胞中不同的Nfu mRNA。为了获得完整的cDNA序列，我们进行5′RACE实验(图。1A类). 基因组序列分析和内含子-外显子边界支持这两种亚型的假设是由核燃料元件前mRNA(图1B类). 外显子I包含两个可选的5′供体剪接位点生成亚型I或亚型II。因此，亚型I含有外显子IA，但不是90-nt外显子IB，而亚型II（HIRIP5）包含两个外显子IA此外，尽管AUG1存在于两个转录本中，在AUG1启动亚型II将导致合成短上游ORF是因为外显子IB中的框内终止密码子终止(图1C). 因此，功能性Nfu亚型II的翻译将在8月2日启动并产生缺乏亚型I的前24个氨基酸的蛋白质。

多重的存在核燃料元件亚型经5′证实RACE和PCR扩增实验。5′RACE的巢式PCR使用AUG1上游引物（引物F1）和外显子引物的产品II–外显子III连接（引物R1）如预期生成202-bp产物对于同型I序列(图。1C 左侧). 相反，使用引物F1和如预测的那样，外显子IB内的引物（引物R2）产生了170-bp的产物来自亚型II的序列。因此，这些结果证实了亚型I和II。使用不同的外显子IB特异性引物（引物F3）也生成了亚型II预期大小的PCR产物(图1C 赖特). 此外，使用带有引物R1的引物F1进行PCR生成292 bp的副产品(图。1C 左侧)，正如对同种型II所预期的那样。这些结果表明，亚型I更丰富，并且与事实上，数据库中的亚型I由>20个EST表示，而亚型II只报告过一次(25).

序列分析进一步表明，这两种Nfu亚型可能是针对不同的亚细胞位置。对识别出的程序进行排序亚型I中假定的线粒体靶向序列，而亚型II缺乏假定的线粒体靶向序列，预计将存在在细胞溶质中(29). 等值线ImRNA编码254个氨基酸的线粒体前体蛋白预计分子量为28.4 kDa，预计将由线粒体将肽酶加工成分子量为21.8千帕(30). 等值线II编码一个230 aa的蛋白质，预测分子量为25.9 kDa。

Nfu异构体针对不同的亚细胞隔室。这个免疫荧光法检测Nfu蛋白的亚细胞定位转染表达载体的COS-7细胞的显微镜观察两种不同的亚型(图。2A类)使用兔多克隆抗体4333对抗纯化的Nfu蛋白。如预期，在转染了构建物的细胞中编码亚型I，在线粒体中检测到染色，根据与线粒体标记MitoTracker 633共定位。相反，当用编码亚型II的构建物转染细胞时，染色在胞浆和细胞核中检测到(图2B类).

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图2。

Nfu同种型I定位于线粒体，而同种型II定位于线粒体到胞浆和细胞核。(A类)的示意图核燃料元件用于的构件在体外翻译和COS-7细胞转染。(B类)转染含有任一亚型的构建物的COS-7细胞用兔多克隆抗体对Nfu（α-Nfu）进行I或亚型II染色4333）和免疫荧光显微镜分析。箭头表示转染细胞。线粒体用MitoTracker 633染色，细胞核用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。

内源性Nfu蛋白的定位也由Western检测印迹分析和免疫沉淀实验。蛋白质印迹分析使用α-Nfu 4333的RD4氚裂解物显示出约22kDa的主带（p22）和≈26 kDa处的一个小带（p26）(图3A类). 亚细胞的分馏表明线粒体部分存在p22，而p26存在于胞浆中(图3A类). 第26页蛋白质似乎与在体外翻译亚型II的产物，这与AUG2产生细胞溶质Nfu(图。三B类). 相反，线粒体中存在p22该组分与28-kDa亚型I的蛋白水解过程一致导入线粒体期间的前体蛋白（p28）。为了验证p28被处理成p22体内，我们进行了代谢标记和脉冲追踪实验。主要的28-kDa带（p28）出现代谢标记15分钟后立即(图3C). 随着时间的推移，p28被迅速加工成一个分裂中间产物（p24），它是进一步加工成成熟线粒体蛋白p22。这些结果是典型的先导序列的两步蛋白水解断裂线粒体蛋白质(31).

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图3。

内源性Nfu蛋白存在于胞质溶胶、线粒体和RD4细胞的细胞核。(A类)亚细胞蛋白质印迹分析使用α-Nfu 4333和α-Nfu-（MAP）的RD4细胞裂解产物的组分4337.核蛋白（Oct-1）和线粒体蛋白的分析（Mn-SOD）进行比较。(B类)蛋白质印迹分析使用α-Nfu 4333的RD4氚裂解物（车道1）。体外pcDNA翻译产物-核燃料元件同种型I，pcDNA-核燃料元件亚型II和对照结构pPoly（a）-荧光素酶显示用于比较。（C） RD4细胞脉冲标记[³⁵S] 蛋氨酸并在指定时间追赶。氚裂解物的免疫沉淀用α-Nfu 4333表示Nfu亚型I的两步加工。(D类)RD4裂解物中内源性Nfu的免疫沉淀免疫沉淀法在体外翻译产品核燃料元件亚型I和II。正如预期，在体外翻译亚型I产生约28kDa的主要蛋白质，而亚型II产生约26 kDa的蛋白质。亚型II的较短产物（≈22 kDa）可能是在体外翻译开始于自动液位计3(图1A类).

此外，脉冲追踪实验提供了动力学数据进一步支持了p26独立靶向胞浆。与线粒体Nfu的两个前体（p28和p24）不同，p26是通过Western blot分析明确检测到(图3A类和B类)，表明p26的半衰期更长。这个脉冲追踪实验表明p26的动力学行为是与p28和p24不同。代谢15分钟后立即标记（chase=0 min），p28和p26之间的生物合成比率为≈20:1。然而，在180分钟的追逐点p28和p26变为6:1，表明p26的半衰期更长。同样，代谢标记2h后，p28在3h追踪时下降了13倍以上点，而p26仅下降了2.6倍。综上所述，这些结果表明p26不是线粒体Nfu的前体独立靶向细胞溶质。

内源性Nfu亚型也通过第二个抗体检测α-Nfu（MAP）4337，针对C中的18-aa肽而升高Nfu的终点。有趣的是，与α-Nfu 4333相比，Western blot使用α-Nfu（MAP）4337进行分析，仅在细胞溶质和细胞核部分，但线粒体部分未检测到p22(图3A类). 西部重组GST融合蛋白的印迹分析表明α-Nfu（MAP）4337完全能够检测这两种亚型在里面体外（未显示数据）。同样，Abs 4333和4337都可以免疫沉淀在体外亚型I的翻译产物或亚型II结构(图。三D类). 因此，通过使用α-Nfu（MAP）4337不仅进一步证明了胞浆和细胞核中的Nfu亚型，但也表明线粒体Nfu C末端的翻译后修饰使得抗体无法检测到Nfu C末端(图3A类).

体外培养人Nfu中铁硫簇的组装。纯化后，人类Nfu样品没有显示出可见的生色团(图4). 关于厌氧铁和硫化物处理（参见材料和方法),重组人Nfu亚型II获得以420纳米(图4)，这是表示[4Fe–4S]²⁺群集(32). 这个Fe-S簇在90分钟内对空气相对稳定，但对铁相关试剂EDTA处理，如EDTA照射下紫外可见吸收带的时间依赖性衰减（未显示数据）。这些结果表明Nfu可以保护其Fe-S簇的氧化降解，即使簇很容易可溶性螯合剂可接近。事实上，纯化后的SyNifU对EDTA也很敏感，很容易转移到去铁氧还蛋白(24).

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图4。

Nfu（43μM）的紫外可见吸收光谱(A类)和之后(B类)在体外群集组件。

穆斯堡尔谱学用于表征Fe–S团簇组装在Nfu上。重组Nfu的4.2-K穆斯堡尔谱在与γ平行的50 mT磁场中记录辐射显示出宽四极偶极子(图5A类，阴影标记）。频谱分析表明，可以用两个具有与[4Fe–4S]²⁺群集(33–38)（请参见表1和图5图例）。A光谱记录温度为4.2 K，在6 T的强平行电场中(图5B类，阴影标记），进一步表明组装在Nfu上的簇具有抗磁性基态，这与[4Fe–4S]²⁺转让。观察到良好的一致性从实验光谱和模拟结果来看，如果不是全部，Nfu样品中的Fe[4Fe–4S]²⁺形态、蛋白质分析和铁确定（参见材料和方法)在上执行穆斯堡尔样品表明样品中含有430μM Nfu单体和840μM铁。这些结果表明，大约有一个[4Fe–4S]簇合物由Nfu的两个单体组装而成。

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图5。

人类Nfu（430μM）的穆斯堡尔谱在体外Fe–S簇的组装。光谱（阴影标记）记录在50 mT磁场中4.2 K(A类)或6吨(B类)平行应用于γ辐射。与实验光谱重叠的实线是使用两个重叠四极偶极子的理论模拟吗以下参数和假设抗磁性：δ=0.47 mm/s，Δ电子_问=1.35 mm/s，且η=0.5（对于双峰1），δ=0.47 mm/s，Δ电子_问=1.09 mm/s，η=双绞线2为0.7。

讨论

我们结合了生物化学和光谱技术研究人类Nfu组装Fe–S簇的能力。打开与铁和硫化物一起孵育，人类Nfu表现出紫外可见和穆斯堡尔谱特征[4Fe–4S]²⁺集群。这些结果，以及蛋白质和铁的分析表明[4Fe–4S]²⁺Nfu的两个单体的簇合。它是重要的是要指出，对于蛋白质结合的[4Fe–4S]²⁺具有完全半胱氨酸的簇配位，在很窄的范围内观察到异构体位移0.42–0.45毫米/秒(表1).Nfu的观测异构体位移为0.47 mm/s[4Fe–4S]²⁺集群相对较高，可能表示非典型协调。^§它有趣的是，酵母铜伴侣蛋白中的铜（I）Atx1仅与两个半胱氨酸残基和一个外源硫醇配位并提出Atx1中独特的协调环境可促进与其特定靶点形成桥联中间体铜转移过程中的蛋白质(40). 可以想象对于人类Nfu来说，Fe–S簇的不完全半胱氨酸连接可能也有助于在支架和目标之间转移完整的簇蛋白质。

我们观察到在厌氧条件下[4Fe–4S]²⁺集群可以组装到人类Nfu上似乎与以前的报告不一致(24)纯化的SyNifU包含[2Fe–2S]²⁺集群。然而，国家可通过实验部分确定组装簇的条件。例如大肠杆菌转录调节因子FNR含有[4Fe–4S]²⁺集群，暴露时转化为氧气，转化为[2Fe–2S]²⁺群集(41). SyNifU纯化自有氧生长的大肠杆菌细胞，这种情况可能会限制组装[4Fe–4S]²⁺集群，导致存在[2Fe–2S]²⁺纯化后的簇蛋白质。有趣的是，[2Fe-2S]的转移²⁺从SyNifU到apoform的集群聚回声囊炎铁氧还蛋白恢复铁氧还蛋白的电子转移活性(24). 为了支持人类Nfu中[4Fe–4S]簇的相关性，IRP1与重组Nfu导致IRP1快速转化为活性胞浆乌头糖，证明Nfu转移其[4Fe–4S]的能力集群至IRP1（W.-H.T.和T.A.R.，未发布数据）。考虑到支架蛋白的拟议功能是组装Fe-S簇和将簇传递给各种靶蛋白不同类型的铁硫簇可能是支架蛋白所需要的。确实，最近的报告(6,12,17,42–44)属于在体外不同化学计量的团簇组装不同的支架蛋白意味着配位位点的灵活性可能是支架蛋白的一个共同特征。

通过组装铁硫簇并将其传递给靶蛋白，支架蛋白促进靶蛋白的成熟，同时保护无化学反应的铁和硫化物中的细胞成分。这个人类Nfu组装[4Fe–4S]簇并转移一个受体蛋白的簇支持Nfu是一个潜在的支架蛋白。以前的研究(27)已经证明哺乳动物细胞也表达IscU和IscA。存在多个潜在脚手架蛋白质增加了每一种可能具有不同特异性的可能性靶蛋白(18). 上另一方面，可以想象这些假定的支架蛋白可能具有附加和/或不同的职能角色体内。对于示例，最近的研究(45)已确定IscS不仅对铁-S簇和tRNA中的硫胺、生物素、硫核苷，以及北美。

在这篇文章中，我们描述了人类Nfu的两种亚型，它们是由一种常见的前信使核糖核酸的选择性剪接产生。与人IscS和不同的人类Nfu亚型靶向线粒体胞浆或细胞核。许多关键的代谢途径，包括氧化磷酸化、血红素生物合成和柠檬酸循环部分发生或完全在线粒体内，以及这些途径中的许多成分其功能需要Fe–S簇。酵母基因研究近况(21,22,46–49)暗示线粒体铁超载可能是受损的直接后果Fe–S簇组装，并可能对细胞产生重大影响功能和生存能力。因此，Fe–S簇组装/修复线粒体的基本过程。然而国际标准委员会细胞溶质和细胞核中的基因也越来越多显而易见。例如，人铁调节蛋白1（IRP1）是一种细胞溶质调节铁相关蛋白表达的铁传感器蛋白IRP1作为翻译调节因子的代谢和活性取决于是否存在[4Fe–4S]²⁺群集(50).

还应注意的是，尽管人类IscS(26)，缺血再灌注(27)和Nfu（本文）可以在多个隔间中清楚地检测到这些酵母的同源物以前只在线粒体中检测到蛋白质(21,22,51)，导致该提案线粒体对铁硫簇组装至关重要(52). 酵母的用途非常不同与人类细胞相比，铁的传感、吸收和储存策略(53). 例如，没有酵母中已鉴定出胞浆IRP同源物。铁的这种分歧酵母和人之间的代谢可能导致对酵母与高等真核生物的铁硫簇组装。尽管内源性酵母Nfs1p（一种IscS同源物）不能通过以下方法在细胞核中检测到蛋白质印迹、最近的核转运陷阱分析和诱变研究(54)清楚地表明Nfs1p的核定位对细胞生存能力至关重要强调线粒体外的生理功能国际标准委员会基因。我们对哺乳动物的研究国际标准委员会基因揭示了三种机制：交替启动密码子在iscS公司(26)，替代选择盒式外显子iscU（国际标准化组织）(27)和的替代使用5′供体剪接位点核燃料元件（本文），函数哺乳动物细胞靶向国际标准委员会不同亚细胞的基因产物位置，暗示着潜在的强大和通用的监管这些蛋白质在不同环境中的协同控制机制隔间。

致谢

笔记

本文直接（第二轨道）提交给PNAS办公室。

缩写：MAP，多重抗原肽。

数据沉积：本文中报告的序列已经沉积在GenBank数据库中（登录号AY286306和AY286107）。

脚注

工具书类